Благодарим ви, че посетихте Nature.com. Версията на браузъра, която използвате, има ограничена CSS поддръжка. За най-добри резултати ви препоръчваме да използвате по-нова версия на браузъра си (или да деактивирате режима на съвместимост в Internet Explorer). Междувременно, за да осигурим постоянна поддръжка, показваме сайта без стилизиране или JavaScript.
Микробният растеж в раните често се проявява като биофилми, които пречат на заздравяването и са трудни за елиминиране. Новите сребърни превръзки твърдят, че се борят с раневи инфекции, но тяхната антибиофилмова ефикасност и независимите от инфекцията лечебни ефекти обикновено са неизвестни. Използвайки in vitro и in vivo модели на биофилм на Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa, ние докладваме за ефективността на превръзки, генериращи Ag1+ йони; Ag1+ превръзки, съдържащи етилендиаминтетраоцетна киселина и бензетониев хлорид (Ag1+/EDTA/BC), и превръзки, съдържащи сребърен нитрат (Ag оксисоли), които произвеждат Ag1+, Ag2+ и Ag3+ йони за борба с раневия биофилм и неговия ефект върху заздравяването. Ag1+ превръзките имат минимално въздействие върху раневия биофилм in vitro и при мишки (C57BL/6j). За разлика от това, оксидираните сребърни соли и Ag1+/EDTA/BC превръзките значително намаляват броя на жизнеспособните бактерии в биофилмите in vitro и демонстрират значително намаляване на бактериалните и EPS компоненти в раневи биофилми при мишки. Тези превръзки имат различен ефект върху заздравяването на рани, инфектирани с биофилм и такива, които не са инфектирани с биофилм, като превръзките с кислородна сол имат по-благоприятен ефект върху реепителизацията, размера на раната и възпалението в сравнение с контролните лечения и други сребърни превръзки. Различните физикохимични свойства на сребърните превръзки могат да имат различен ефект върху биофилма на раната и заздравяването ѝ и това трябва да се има предвид при избора на превръзка за лечение на рани, инфектирани с биофилм.
Хроничните рани се определят като „рани, които не преминават през нормалните етапи на заздравяване по организиран и навременен начин“1. Хроничните рани създават психологическа, социална и икономическа тежест за пациентите и здравната система. Годишните разходи на NHS за лечение на рани и свързаните с тях съпътстващи заболявания се оценяват на 8,3 милиарда британски лири през периода 2017–2018 г. Хроничните рани също са належащ проблем в момента в Съединените щати, като Medicare оценява годишните разходи за лечение на пациенти с рани на 28,1–96,8 милиарда долара3.
Инфекцията е основен фактор, който възпрепятства заздравяването на рани. Инфекциите често се проявяват като биофилми, които присъстват в 78% от незарастващите хронични рани. Биофилмите се образуват, когато микроорганизмите се прикрепят необратимо към повърхности, като например раневи повърхности, и могат да се агрегират, за да образуват извънклетъчни полимерни (EPS) общности. Раневият биофилм е свързан с повишена възпалителна реакция, водеща до увреждане на тъканите, което може да забави или предотврати заздравяването4. Увеличаването на увреждането на тъканите може да се дължи отчасти на повишената активност на матриксни металопротеинази, колагеназа, еластаза и реактивни кислородни видове5. Освен това, възпалителните клетки и биофилми самите по себе си са големи консуматори на кислород и следователно могат да причинят локална тъканна хипоксия, изчерпвайки жизненоважния кислород на клетките, необходим за ефективно възстановяване на тъканите6.
Зрелите биофилми са силно устойчиви на антимикробни средства, което изисква агресивни стратегии за контрол на инфекциите с биофилми, като например механично третиране, последвано от ефективно антимикробно лечение. Тъй като биофилмите могат бързо да се регенерират, ефективните антимикробни средства могат да намалят риска от повторно образуване след хирургично отстраняване на рани7.
Среброто се използва все по-често в антимикробни превръзки и често се използва като лечение от първа линия за хронично инфектирани рани. В търговската мрежа се предлагат много сребърни превръзки, всяка от които съдържа различен състав, концентрация и основна матрица на среброто. Напредъкът в сребърните превръзки доведе до разработването на нови сребърни превръзки. Металната форма на среброто (Ag0) е инертна; за да се постигне антимикробна ефективност, то трябва да загуби електрон, за да образува йонно сребро (Ag1+). Традиционните сребърни превръзки съдържат сребърни съединения или метално сребро, които при излагане на течност се разлагат, за да образуват Ag1+ йони. Тези Ag1+ йони реагират с бактериалната клетка, премахвайки електрони от структурни компоненти или критични процеси, необходими за оцеляване. Патентована технология доведе до разработването на ново сребърно съединение, Ag оксисоли (сребърен нитрат, Ag7NO11), което се включва в превръзките за рани. За разлика от традиционното сребро, разграждането на кислородсъдържащи соли води до състояния на сребро с по-висока валентност (Ag1+, Ag2+ и Ag3+). In vitro проучвания показват, че ниските концентрации на окислени сребърни соли са по-ефективни от еднойонното сребро (Ag1+) срещу патогенни бактерии като Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus и Escherichia coli8,9. Друг нов вид сребърна превръзка включва допълнителни съставки, а именно етилендиаминтетраоцетна киселина (EDTA) и бензетониев хлорид (BC), за които се съобщава, че са насочени към биофилма EPS и по този начин увеличават проникването на среброто в биофилма. Тези нови сребърни технологии предлагат нови начини за насочване към раневи биофилми. Въздействието на тези антимикробни средства върху раневата среда и независимото от инфекцията заздравяване обаче е важно, за да се гарантира, че те не създават неблагоприятна ранева среда или не забавят заздравяването. Съобщава се за опасения относно цитотоксичността на среброто in vitro при няколко сребърни превръзки10,11. Въпреки това, цитотоксичността in vitro все още не се е превърнала в токсичност in vivo и няколко Ag1+ превръзки са показали добър профил на безопасност12.
Тук изследвахме ефективността на карбоксиметилцелулозни превръзки, съдържащи нови сребърни формули, срещу ранев биофилм in vitro и in vivo. Освен това бяха оценени ефектите на тези превръзки върху имунните отговори и заздравяването, независимо от инфекцията.
Всички използвани превръзки са търговски достъпни. 3M Kerracel Gel Fiber Dressing (3M, Knutsford, UK) е неантимикробна 100% карбоксиметилцелулозна (CMC) гел превръзка от влакна, която е използвана като контролна превръзка в това проучване. Оценени са три антимикробни CMC сребърни превръзки, а именно 3M Kerracel Ag превръзка (3M, Knutsford, UK), която съдържа 1,7 тегл.% кислородна сребърна сол (Ag7NO11) във сребърни йони с по-висока валенция (Ag1+, Ag2+ и Ag3+). По време на разлагането на Ag7NO11, йоните Ag1+, Ag2+ и Ag3+ се образуват в съотношение 1:2:4. Превръзка Aquacel Ag Extra, съдържаща 1,2% сребърен хлорид (Ag1+) (ConvaTec, Deeside, UK) 13 и превръзка Aquacel Ag + Extra, съдържаща 1,2% сребърен хлорид (Ag1+), EDTA и бензетониев хлорид (ConvaTec, Deeside, UK) 14.
Щамовете, използвани в това проучване, са Pseudomonas aeruginosa NCTC 10781 (Public Health England, Salisbury) и Staphylococcus aureus NCTC 6571 (Public Health England, Salisbury).
Бактериите бяха култивирани за една нощ в бульон Muller-Hinton (Oxoid, Altrincham, UK). След това нощната култура беше разредена 1:100 в бульон Mueller-Hinton и 200 µl бяха поставени върху стерилни 0.2 µm циклопорни мембрани Whatman (Whatman plc, Maidstone, UK) върху агарови плаки Mueller-Hinton (Sigma-Aldrich Company Ltd, Kent, Великобритания). Образуване на колониален биофилм при 37°C за 24 часа. Тези колониални биофилми бяха тествани за логаритмично свиване.
Нарежете превръзката на квадратни парчета от 3 cm2 и ги навлажнете предварително със стерилна дейонизирана вода. Поставете превръзката върху биофилма на колонията върху агаровата плака. Всеки 24 ha биофилм беше отстранен и жизнеспособните бактерии в биофилма (CFU/ml) бяха количествено определени чрез серийно разреждане (10−1 до 10−7) в неутрализационен бульон Day-Angle (Merck-Millipore). След 24 часа инкубация при 37°C бяха извършени стандартни преброявания на плаките с агар Mueller-Hinton. Всяко третиране и времева точка бяха извършени в три екземпляра и преброяванията на плаките бяха повторени за всяко разреждане.
Кожа от свински корем се получава от женски прасета от породата Големи бели прасета в рамките на 15 минути след клане в съответствие със стандартите за износ на Европейския съюз. Кожата е обръсната и почистена с алкохолни кърпички, след което е замразена при -80°C за 24 часа, за да се девитализира. След размразяване, парчета кожа от 1 cm2 са измити три пъти с PBS, 0,6% натриев хипохлорит и 70% етанол в продължение на 20 минути всеки път. Преди отстраняване на епидермиса, останалият етанол е отстранен чрез трикратно измиване в стерилен PBS. Кожата е култивирана в 6-ямкова плака с найлонова мембрана с дебелина 0,45 μm (Merck-Millipore) отгоре и 3 абсорбиращи тампона (Merck-Millipore), съдържащи 3 ml фетален говежди серум (Sigma), допълнен с 10% модифицирана среда Eagle на Dulbecco (Dulbecco's Modified Eagle Medium – Aldrich Ltd.).
Колониалните биофилми бяха култивирани, както е описано за изследвания на експозицията на биофилм. След култивиране на биофилма върху мембраната в продължение на 72 часа, биофилмът беше приложен върху повърхността на кожата с помощта на стерилна инокулационна бримка и мембраната беше отстранена. След това биофилмът беше инкубиран върху дермата на прасето за допълнителни 24 часа при 37°C, за да може биофилмът да узрее и да се прилепи към кожата на прасето. След като биофилмът узрее и се прикрепи, превръзка от 1,5 cm2, предварително навлажнена със стерилна дестилирана вода, беше приложена директно върху повърхността на кожата и инкубирана при 37°C в продължение на 24 часа. Жизнеспособните бактерии бяха визуализирани чрез оцветяване чрез равномерно нанасяне на реагента за жизнеспособност на клетките PrestoBlue (Invitrogen, Life Technologies, Paisley, UK) върху апикалната повърхност на всеки експлант и инкубиране в продължение на 5 минути. Използвайте цифровата камера Leica DFC425 за незабавно заснемане на изображения на микроскопа Leica MZ8. Зоните, оцветени в розово, бяха количествено определени с помощта на софтуера Image Pro версия 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD Image-Pro (mediacy.com)). Сканиращата електронна микроскопия беше извършена както е описано по-долу.
Бактериите, култивирани през нощта, бяха разредени 1:100 в бульон Mueller-Hinton. 200 μl от културата бяха добавени към стерилна 0,2 μm циклопорна мембрана Whatman (Whatman, Maidstone, UK) и поставени върху агар Mueller-Hinton. Биофилмните плаки бяха инкубирани при 37°C в продължение на 72 часа, за да се позволи образуването на зрял биофилм.
След 3 дни зреене на биофилма, директно върху него беше поставена квадратна превръзка с площ от 3 cm2 и инкубирана при 37°C в продължение на 24 часа. След отстраняване на превръзката от повърхността на биофилма, към повърхността на всеки биофилм беше добавен 1 ml от реагента за жизнеспособност на клетките PrestoBlue (Invitrogen, Waltham, MA) за 20 секунди. Повърхностите бяха изсушени, преди промените в цвета да бъдат регистрирани с помощта на цифров фотоапарат Nikon D2300 (Nikon UK Ltd., Kingston, UK).
Пригответе култури за една нощ върху Mueller-Hinton агар, прехвърлете отделните колонии в 10 ml Mueller-Hinton бульон и инкубирайте на клатачка при 37°C (100 rpm). След инкубация за една нощ, културата беше разредена 1:100 в Mueller-Hinton бульон и 300 µl бяха нанесени върху 0.2 µm кръгла Whatman циклопорна мембрана (Whatman International, Maidstone, UK) върху Mueller-Hinton агар и инкубирани при 37°C в рамките на 72 часа. . Зрелият биофилм беше приложен върху раната, както е описано по-долу.
Цялата работа с животни е извършена в Университета в Манчестър по лиценз за проект, одобрен от Службата за хуманно отношение към животните и етичен преглед (P8721BD27), и в съответствие с насоките, публикувани от Министерството на вътрешните работи съгласно ревизирания ASPA от 2012 г. Всички автори са се придържали към насоките за пристигане. Осемседмични мишки C57BL/6j (Envigo, Oxon, UK) са използвани за всички in vivo проучвания. Мишките са анестезирани с изофлуран (Piramal Critical Care Ltd, West Drayton, UK) и гръбните им повърхности са обръснати и почистени. След това на всяка мишка е направена ексцизионна рана 2 × 6 mm с помощта на биопсичен перфоратор Stiefel (Schuco International, Hertfordshire, UK). За рани, инфектирани с биофилм, се прилага 72-часов колониален биофилм, отгледан върху мембраната, както е описано по-горе, върху дермалния слой на раната, като се използва стерилна инокулационна бримка веднага след нараняването, и мембраната се изхвърля. Един квадратен сантиметър превръзка е предварително навлажнен със стерилна вода, за да се поддържа влажна среда на раната. Превръзките бяха поставени директно върху всяка рана и покрити с 3M Tegaderm филм (3M, Bracknell, UK) и течно лепило Mastisol (Eloquest Healthcare, Ferndale, MI), нанесено по краищата, за да се осигури допълнителна адхезия. Бупренорфин (Animalcare, York, UK) беше приложен в концентрация от 0,1 mg/kg като аналгетик. Мишките бяха умъртвени три дни след нараняване, използвайки метода от Schedule 1, и областта на раната беше отстранена, разполовена и съхранена, ако е необходимо.
Оцветяването с хематоксилин (ThermoFisher Scientific) и еозин (ThermoFisher Scientific) беше извършено съгласно протокола на производителя. Площта на раната и реепителизацията бяха количествено определени с помощта на софтуера Image Pro версия 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD).
Тъканните срези бяха депарафинизирани в ксилен (ThermoFisher Scientific, Loughborough, UK), рехидратирани със 100–50% етанол и потопени за кратко в дейонизирана вода (ThermoFisher Scientific). Имунохистохимията беше извършена с помощта на комплекта VectaStain Elite ABC PK-6104 (Vector Laboratories, Burlingame, CA) съгласно протокола на производителя. Първичните антитела към неутрофили NIMP-R14 (Thermofisher Scientific) и макрофаги Ms CD107b Pure M3/84 (BD Biosciences, Wokingham, UK) бяха разредени 1:100 в блокиращ разтвор и добавени към повърхността на среза, последвано от 2 антитела Anti-, VectaStain ABC и комплекта Vector Nova Red Peroxidase (HRP) substrate (Vector Laboratories, Burlingame, CA) и контраоцветени с хематоксилин. Изображенията са получени с помощта на микроскоп Olympus BX43 и цифров фотоапарат Olympus DP73 (Olympus, Саутенд-он-Сий, Великобритания).
Кожните проби бяха фиксирани в 2,5% глутаралдехид и 4% формалдехид в 0,1 M HEPES (pH 7,4) в продължение на 24 часа при 4°C. Пробите бяха дехидратирани с помощта на градуиран етанол и изсушени в CO2 с помощта на сушилня за критични точки Quorum K850 (Quorum Technologies Ltd, Loughton, UK) и покрити чрез разпрашаване със златно-паладиева сплав с помощта на мини система за разпрашаване/тлеещ разряд Quorum SC7620. Пробите бяха изобразени с помощта на сканиращ електронен микроскоп FEI Quanta 250 (ThermoFisher Scientific), за да се визуализира централната точка на раната.
Тото-1 йодид (2 μM) беше приложен върху изрязаната повърхност на раната на мишка и инкубиран в продължение на 5 минути при 37 °C (ThermoFisher Scientific) и третиран със Syto-60 (10 μM) при 37 °C (ThermoFisher Scientific). 15-минутни Z-stack изображения бяха създадени с помощта на Leica TCS SP8.
Биологичните и техническите данни от повторенията бяха таблично представени и анализирани с помощта на софтуера Graphpad Prism V9 (GraphPad Software, Ла Хоя, Калифорния). За тестване на разликите между всяко третиране и контролната превръзка без антимикробни вещества беше използван еднофакторен дисперсионен анализ с множество сравнения, използващ post hoc теста на Dunnett. p-стойност <0,05 се счита за значима.
Ефективността на влакнестите превръзки със сребърен гел беше оценена за първи път in vitro срещу колонии от биофилм на Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa. Сребърните превръзки съдържат различни формули на сребро: традиционните сребърни превръзки произвеждат Ag1+ йони; сребърните превръзки, които могат да произвеждат Ag1+ йони след добавяне на EDTA/BC, могат да разрушат матрицата на биофилма и да изложат бактериите на сребро под антибактериалния ефект на сребърните йони15 и превръзки, съдържащи оксидирани сребърни соли, които произвеждат Ag1+, Ag2+ и Ag3+ йони. Ефективността им беше сравнена с неантимикробна контролна превръзка, направена от желирани влакна. Останалите жизнеспособни бактерии в биофилма бяха оценявани на всеки 24 часа в продължение на 8 дни (Фигура 1). На 5-ия ден биофилмът беше реинокулиран с 3,85 × 105S Staphylococcus aureus или 1,22×105P. aeruginosa, за да се оцени възстановяването на биофилма. В сравнение с контролните превръзки без антимикробно действие, превръзките с Ag1+ имат минимален ефект върху бактериалната жизнеспособност в биофилмите на Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa в продължение на 5 дни. За разлика от тях, превръзките, съдържащи оксидирано Ag и Ag1+ + EDTA/BC соли, са ефективни в унищожаването на бактериите в биофилма в рамките на 5 дни. След многократна инокулация с планктонни бактерии на 5-ия ден не се наблюдава възстановяване на биофилма (фиг. 1).
Количествено определяне на жизнеспособни бактерии в биофилми от Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa след третиране със сребърни превръзки. Колониите от биофилм от Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa бяха третирани със сребърни превръзки или контролни превръзки без антимикробни вещества, а броят на останалите жизнеспособни бактерии беше определян на всеки 24 часа. След 5 дни биофилмът беше реинокулиран с 3,85×105S. Staphylococcus aureus или 1,22×105P. Колониите от бактериопланктона Pseudomonas aeruginosa бяха формирани поотделно, за да се оцени възстановяването на биофилма. Графиките показват средна стойност +/- стандартна грешка.
За да се визуализира ефектът на сребърните превръзки върху жизнеспособността на биофилма, превръзките бяха приложени върху зрели биофилми, отгледани върху свинска кожа ex vivo. След 24 часа превръзката се отстранява и биофилмът се оцветява със синьо реактивно багрило, което се метаболизира от живи бактерии до розов цвят. Биофилмите, третирани с контролни превръзки, бяха розови, което показва наличието на жизнеспособни бактерии в биофилма (Фигура 2А). За разлика от това, биофилмът, третиран с превръзката Ag oxysols, беше предимно син, което показва, че останалите бактерии на повърхността на кожата на свинята са нежизнеспособни бактерии (Фигура 2B). Смесено синьо и розово оцветяване се наблюдава в биофилми, третирани с превръзки, съдържащи Ag1+, което показва наличието на жизнеспособни и нежизнеспособни бактерии в биофилма (Фигура 2C), докато превръзките EDTA/BC, съдържащи Ag1+, бяха предимно сини с някои розови петна, което показва области, които не са засегнати от сребърната превръзка (Фигура 2D). Количественото определяне на активните (розови) и неактивните (сини) области показа, че контролният пластир е бил 75% активен (Фигура 2E). Превръзките Ag1+ + EDTA/BC се представят подобно на превръзките с оксидирани сребърни соли, с процент на преживяемост съответно 13% и 14%. Превръзката Ag1+ също така намалява жизнеспособността на бактериите с 21%. Тези биофилми са наблюдавани с помощта на сканираща електронна микроскопия (SEM). След третиране с контролната превръзка и превръзката Ag1+ е наблюдаван слой от Pseudomonas aeruginosa, покриващ свинската кожа (Фигура 2F,H), докато след третиране с превръзката Ag1+ са открити малко бактериални клетки и малко бактериални клетки отдолу. Колагеновите влакна могат да се разглеждат като тъканната структура на свинската кожа (Фигура 2G). След третиране с превръзка Ag1+ + EDTA/BC, са видими бактериални плаки и подлежащи плаки от колагенови влакна (Фигура 2I).
Визуализация на биофилм на Pseudomonas aeruginosa след третиране със сребърна превръзка. (A–D) Бактериалната жизнеспособност в биофилми на Pseudomonas aeruginosa, отгледани върху свинска кожа, беше визуализирана с помощта на багрило PrestoBlue 24 часа след третиране със сребърни превръзки или контролни превръзки без антимикробни вещества. Живите бактерии са розови, нежизнеспособните бактерии и свинската кожа са сини. (E) Количествено определяне на биофилми на Pseudomonas aeruginosa, отгледани върху свинска кожа (розово петно), използвайки сканираща електронна микроскопия Image Pro версия 10 (FI) и третирани със сребърна превръзка или контролна превръзка без антимикробни вещества в продължение на 24 часа. SEM скала = 5 µm. (J–M) Колониалните биофилми, отгледани върху филтри, бяха оцветени с реактивно багрило PrestoBlue след 24 часа инкубация със сребърни превръзки.
За да се определи дали близкият контакт между превръзките и биофилмите влияе върху ефективността им, колониални биофилми, поставени върху равна повърхност, бяха третирани с превръзките в продължение на 24 часа и след това оцветени с реактивни багрила. Нетретираният биофилм беше тъмнорозов на цвят (Фигура 2J). За разлика от биофилмите, третирани с превръзки, съдържащи оксидирани сребърни соли (Фигура 2K), биофилмите, третирани с превръзки, съдържащи Ag1+ или Ag1+ + EDTA/BC, показаха ленти с розово оцветяване (Фигура 2L,M). Това розово оцветяване показва наличието на жизнеспособни бактерии и е свързано с областта на шева в превръзката. Тези зашити области създават мъртви пространства, които позволяват на бактериите в биофилма да оцелеят.
За да се оцени ефективността на сребърните превръзки in vivo, рани с пълна дебелина на мишки, заразени със зрели биофилми от S. aureus и P. aeruginosa, бяха третирани с контролни превръзки без антимикробни средства или сребърни превръзки. След 3 дни лечение, макроскопският анализ на изображението показа по-малки размери на раните при третиране с превръзки с кислородна сол в сравнение с контролните превръзки без антимикробни средства и други сребърни превръзки (Фигура 3A-H). За да се потвърдят тези наблюдения, раните бяха събрани и площта на раната и реепителизацията бяха количествено определени върху тъканни срези, оцветени с хематоксилин и еозин, използвайки софтуера image pro версия 10 (Фигура 3I-L).
Ефектът на сребърните превръзки върху повърхността на раната и реепителизация на рани, инфектирани с биофилми. (A–H) Малки клетки, инфектирани с биофилми от Pseudomonas aeruginosa (A–D) и Staphylococcus aureus (E–H) след тридневно лечение с неантимикробна контролна превръзка, превръзка с кислородна сребърна сол, превръзка с Ag1+ и превръзка с Ag1+. Представителни макроскопски изображения. Рани на мишки с превръзка Ag1+ + EDTA/BC. (IL) Представителна инфекция с Pseudomonas aeruginosa, хистологични срези, оцветени с хематоксилин и еозин, използвани за количествено определяне на площта на раната и регенерацията на епитела. Количествено определяне на площта на раната (M, O) и процент реепителизация (N, P) на рани, инфектирани с биофилми от Pseudomonas aeruginosa (M, N) и Staphylococcus aureus (O, P) (за лекувана група n = 12). Графиките показват средна стойност +/- стандартна грешка. * означава p = < 0,05 ** означава p = < 0,01; Макроскопски мащаб = 2,5 mm, хистологичен мащаб = 500 µm.
Количественото определяне на площта на раната при рани, инфектирани с биофилм на Pseudomonas aeruginosa (Фигура 3M), показа, че раните, третирани с Ag оксисоли, имат среден размер на раната от 2,5 mm2, докато контролната превръзка без антимикробно вещество има среден размер на раната от 3,1 mm2, което не е вярно. достигна статистическа значимост (Фигура 3M). p = 0,423). Раните, третирани с Ag1+ или Ag1+ + EDTA/BC, не показват намаление на площта на раната (съответно 3,1 mm2 и 3,6 mm2). Лечението с оксигенирана превръзка със сол на сребро насърчава реепителизацията в по-голяма степен, отколкото контролната превръзка без антимикробно вещество (съответно 34% и 15%; p = 0,029) и Ag1+ или Ag1+ + EDTA/BC (съответно 10% и 11%) (Фигура 3N). . , съответно).
Подобни тенденции в площта на раната и регенерацията на епитела са наблюдавани при рани, инфектирани с биофилми от S. aureus (Фигура 3O). Превръзките, съдържащи оксидирани сребърни соли, са намалили площта на раната (2,0 mm2) с 23% в сравнение с контролната неантимикробна превръзка (2,6 mm2), въпреки че това намаление не е било значително (p = 0,304) (Фиг. 3O). Освен това, площта на раната в групата, лекувана с Ag1+, е била леко намалена (2,4 mm2), докато раната, третирана с превръзка Ag1+ + EDTA/BC, не е намалила площта на раната (2,9 mm2). Кислородните соли на Ag също така са насърчили реепителизацията на рани, инфектирани с биофилм от S. aureus (31%), в по-голяма степен, отколкото тези, третирани с контролни превръзки без антимикробни вещества (12%, p = 0,003) (Фигура 3P). Превръзката Ag1+ (16%, p = 0,903) и превръзката Ag+1 + EDTA/BC (14%, p = 0,965) показаха нива на епителна регенерация, подобни на контролната група.
За да се визуализира ефектът на сребърните превръзки върху матрицата на биофилма, беше извършено оцветяване с Toto 1 и Syto 60 йодид (фиг. 4). Toto 1 йодидът е клетъчно-непропускливо багрило, което може да се използва за точно визуализиране на извънклетъчните нуклеинови киселини, които са в изобилие в EPS на биофилмите. Syto 60 е клетъчно-пропускливо багрило, използвано като контрастно оцветяване16. Наблюдения на Toto 1 и Syto 60 йодид в рани, инокулирани с биофилми от Pseudomonas aeruginosa (Фигура 4A-D) и Staphylococcus aureus (Фигура 4I-L) показаха, че след 3 дни лечение с превръзка, EPS в биофилма е значително намален. Превръзките, съдържащи оксидирани соли Ag и Ag1+ + EDTA/BC. Ag1+ превръзките без допълнителни антибиофилмови компоненти значително намаляват клетъчната ДНК в рани, инокулирани с Pseudomonas aeruginosa, но са по-малко ефективни при рани, инокулирани със Staphylococcus aureus.
In vivo изобразяване на ранев биофилм след 3 дни лечение с контролни или сребърни превръзки. Конфокални изображения на Pseudomonas aeruginosa (A–D) и Staphylococcus aureus (I–L), оцветени с Toto 1 (зелено) за визуализиране на извънклетъчни нуклеинови киселини, компонент на полимерите на извънклетъчния биофилм. За оцветяване на вътреклетъчните нуклеинови киселини използвайте Syto 60 (червено). киселини. P. Сканираща електронна микроскопия на рани, инфектирани с биофилми на Pseudomonas aeruginosa (E–H) и Staphylococcus aureus (M–P) след 3 дни лечение с контролни и сребърни превръзки. SEM скала = 5 µm. Конфокална скала за изобразяване = 50 µm.
Сканиращата електронна микроскопия показа, че мишките, инокулирани с биофилмни колонии от Pseudomonas aeruginosa (Фигура 4E-H) и Staphylococcus aureus (Фигура 4M-P), имат значително по-малко бактерии в раните си след 3 дни лечение с изцяло сребърни превръзки.
За да се оцени ефектът на сребърните превръзки върху възпалението на рани при мишки, инфектирани с биофилм, срези от рани, инфектирани с биофилм, третирани с контролни или сребърни превръзки в продължение на 3 дни, бяха имунохистохимично оцветени с помощта на антитела, специфични за неутрофили и макрофаги. Количествено определяне на неутрофили и макрофаги вътрешно. гранулационна тъкан. Фигура 5). Всички сребърни превръзки намалиха броя на неутрофилите и макрофагите в рани, инфектирани с Pseudomonas aeruginosa, в сравнение с контролните превръзки без антимикробни средства след три дни лечение. Въпреки това, лечението с превръзка с оксидирана сребърна сол доведе до по-голямо намаляване на неутрофилите (p = <0,0001) и макрофагите (p = <0,0001) в сравнение с други тествани сребърни превръзки (Фигура 5I,J). Въпреки че Ag1+ + EDTA/BC имаше по-голям ефект върху биофилма на раната, той намали нивата на неутрофилите и макрофагите в по-малка степен от превръзката Ag1+. Умерени рани, инфектирани с биофилм от S. aureus, са наблюдавани и след превръзка с оксизоли от Ag (p = <0,0001), Ag1+ (p = 0,0008) и Ag1++ EDTA/BC (p = 0,0043) в сравнение с контролната група. Подобни тенденции се наблюдават и при превръзка за неутропения (фиг. 5K). Въпреки това, само превръзката с оксигенирана сребърна сол показва значително намаляване на броя на макрофагите в гранулационната тъкан в сравнение с контролната група при рани, инфектирани с биофилми от S. aureus (p = 0,0339) (Фигура 5L).
Неутрофилите и макрофагите бяха количествено определени в рани, инфектирани с биофилми от Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus, след 3 дни лечение с контролни или сребърни превръзки без антимикробен препарат. Неутрофилите (AD) и макрофагите (EH) бяха количествено определени в тъканни срези, оцветени с антитела, специфични за неутрофили или макрофаги. Количествено определяне на неутрофили (I и K) и макрофаги (J и L) в рани, инфектирани с биофилми от Pseudomonas aeruginosa (I и J) и Staphylococcus aureus (K и L). N = 12 на група. Графиките показват средна стойност +/- стандартна грешка, стойности на значимост в сравнение с контролна превръзка без антибактериален препарат, * означава p = < 0,05, ** означава p = < 0,01; *** означава p = < 0,001; показва p = < 0,0001).
След това оценихме ефекта на сребърните превръзки върху заздравяването, независимо от инфекцията. Неинфектираните ексцизионни рани бяха третирани с контролна превръзка без антимикробно действие или със сребърна превръзка в продължение на 3 дни (Фигура 6). Сред тестваните сребърни превръзки, само раните, третирани с превръзката с кислородна сол, изглеждаха по-малки на макроскопски изображения от раните, третирани с контролната група (Фигура 6A-D). Количественото определяне на площта на раната чрез хистологичен анализ показа, че средната площ на раната след лечение с превръзката Ag oxysols е била 2,35 mm2 в сравнение с 2,96 mm2 за рани, третирани с контролната група, но тази разлика не достигна статистическа значимост (p = 0,488) (Фиг. 6I). За разлика от това, не се наблюдава намаляване на площта на раната след лечение с превръзки Ag1+ (3,38 mm2, p = 0,757) или Ag1+ + EDTA/BC (4,18 mm2, p = 0,054) в сравнение с контролната група. Наблюдавана е повишена епителна регенерация при превръзката с Ag оксизол в сравнение с контролната група (съответно 30% срещу 22%), въпреки че това не е достигнало значимост (p = 0,067), но е доста значимо и потвърждава предишни резултати. Превръзката с оксизоли насърчава реепителизацията. -Епителизация на неинфектирани рани17. За разлика от това, лечението с превръзки Ag1+ или Ag1+ + EDTA/BC не е показало ефект или е показало намалена реепителизация в сравнение с контролната група.
Ефект на сребърна превръзка за рани върху заздравяването на рани при незаразени мишки с пълна резекция. (AD) Представителни макроскопски изображения на рани след три дни лечение с контролна превръзка без антимикробно действие и сребърна превръзка. (EH) Представителни срези от рани, оцветени с хематоксилин и еозин. Количественото определяне на площта на раната (I) и процентът на реепителизация (J) са изчислени от хистологични срези в средната точка на раната, използвайки софтуер за анализ на изображения (n = 11–12 на лекувана група). Графиките показват средна стойност +/- стандартна грешка. * означава p = <0,05.
Среброто има дълга история на употреба като антимикробна терапия при заздравяване на рани, но многото различни формулировки и методи на доставяне могат да доведат до разлики в антимикробната ефикасност 18. Освен това, свойствата на антибиофилма на специфични системи за доставяне на сребро не са напълно изяснени. Въпреки че имунният отговор на гостоприемника е относително ефективен срещу планктонни бактерии, той като цяло е по-малко ефективен срещу биофилми 19. Планктонните бактерии лесно се фагоцитират от макрофаги, но в рамките на биофилмите агрегираните клетки създават допълнителни проблеми, като ограничават отговора на гостоприемника до степен, в която имунните клетки могат да претърпят апоптоза и да освободят провъзпалителни фактори, за да засилят имунния отговор 20. Наблюдавано е, че някои левкоцити могат да проникнат в биофилми 21, но не са в състояние да фагоцитират бактерии, след като тази защита е компрометирана 22. Трябва да се използва холистичен подход за подпомагане на имунния отговор на гостоприемника срещу инфекция на раневия биофилм. Дебридментът на раната може физически да разруши биофилма и да премахне по-голямата част от бионатоварването, но имунният отговор на гостоприемника може да бъде неефективен срещу оставащия биофилм, особено ако имунният отговор на гостоприемника е компрометиран. По този начин, антимикробните терапии, като например сребърните превръзки, могат да подпомогнат имунния отговор на гостоприемника и да елиминират инфекциите с биофилм. Съставът, концентрацията, разтворимостта и субстратът за доставяне могат да повлияят на антимикробната ефективност на среброто. През последните години напредъкът в технологията за обработка на сребро направи тези превръзки по-ефективни9,23. С напредването на технологията за сребърни превръзки е важно да се разбере ефективността на тези превръзки за контролиране на инфекцията на раната и, по-важното, въздействието на тези мощни форми на сребро върху раната и заздравяването.
В това проучване сравнихме ефективността на две усъвършенствани сребърни превръзки с конвенционални сребърни превръзки, които произвеждат Ag1+ йони срещу биофилми, използвайки различни in vitro и in vivo модели. Също така оценихме ефекта на тези превръзки върху раневата среда и независимото от инфекцията заздравяване. За да се сведе до минимум влиянието на матрицата за доставяне, всички тествани сребърни превръзки бяха съставени от карбоксиметилцелулоза.
Нашата предварителна оценка на тези сребърни превръзки срещу колониални биофилми от Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus показва, че за разлика от традиционните Ag1+ превръзки, две усъвършенствани сребърни превръзки, Ag1+ + EDTA/BC и окислени Ag соли, са ефективни при 5. Ефективно убивайки бактериите в биофилма в рамките на няколко дни. В допълнение, тези превръзки предотвратяват повторното образуване на биофилм при многократно излагане на планктонни бактерии. Превръзката Ag1+ съдържаше сребърен хлорид, същото сребърно съединение и основна матрица като Ag1+ + EDTA/BC и имаше ограничен ефект върху бактериалната жизнеспособност в биофилма за същия период. Наблюдението, че превръзка Ag1+ + EDTA/BC е по-ефективна срещу биофилм, отколкото превръзка Ag1+, състояща се от същата матрица и сребърно съединение, подкрепя идеята, че са необходими допълнителни съставки, за да се увеличи ефективността на сребърния хлорид срещу биофилм, както е съобщено другаде15. Тези резултати подкрепят идеята, че BC и EDTA играят допълнителна роля, допринасяща за цялостната ефективност на превръзките, и че липсата на този компонент в превръзките Ag1+ може да е допринесла за невъзможността да се демонстрира ефикасност in vitro. Установихме, че окислените превръзки с Ag-сол, произвеждащи Ag2+ и Ag3+ йони, показват по-силна антибактериална ефикасност от Ag1+ и на нива, подобни на Ag1+ + EDTA/BC. Въпреки това, поради високия редокс потенциал, не е ясно колко дълго Ag3+ йоните остават активни и ефективни срещу раневи биофилми и следователно заслужават по-нататъшно проучване. Освен това има много различни превръзки, които генерират Ag1+ йони, които не са тествани в това проучване. Тези превръзки са съставени от различни сребърни съединения, концентрации и основни матрици, което може да повлияе на доставянето на Ag1+ йони и тяхната ефективност срещу биофилми. Също така е важно да се отбележи, че има много различни in vitro и in vivo модели, използвани за оценка на ефективността на превръзките за рани срещу биофилми. Видът на използвания модел, както и съдържанието на сол и протеини в използваната среда в тези модели, ще повлияят на ефективността на превръзката. В нашия in vivo модел, ние позволихме на биофилма да узрее in vitro и след това го прехвърлихме върху дермалната повърхност на раната. Имунният отговор на гостоприемника-мишка е относително ефективен срещу планктонни бактерии, приложени върху раната, като по този начин образува биофилм, докато раната заздравява. Добавянето на зрял биофилм към раната ограничава ефективността на имунния отговор на гостоприемника към образуването на биофилм, като позволява на зрелия биофилм да се установи в раната, преди да може да започне заздравяването. По този начин, нашият модел ни позволява да оценим ефективността на антимикробните превръзки върху зрелите биофилми, преди раните да започнат да заздравяват.
Установихме също, че прилягането на превръзката влияе върху ефективността на сребърните превръзки върху in vitro отгледани биофилми и свинска кожа. Близкият контакт с раната се счита за критичен за антимикробната ефективност на превръзката24,25. Превръзките, съдържащи оксидирани сребърни соли, са били в близък контакт със зрели биофилми, което е довело до значително намаляване на броя на жизнеспособните бактерии в биофилма след 24 часа. За разлика от това, когато са третирани с превръзки Ag1+ и Ag1+ + EDTA/BC, е останал значителен брой жизнеспособни бактерии. Тези превръзки съдържат шевове по цялата дължина на превръзката, което създава мъртви пространства, които предотвратяват близък контакт с биофилма. В нашите in vitro проучвания тези неконтактни области са предотвратили унищожаването на жизнеспособни бактерии в биофилма. Оценихме жизнеспособността на бактериите само след 24 часа третиране; С течение на времето, когато превръзката стане по-наситена, може да има по-малко мъртво пространство, намалявайки площта за тези жизнеспособни бактерии. Това обаче подчертава значението на състава на превръзката, а не само на вида сребро в превръзката.
Въпреки че in vitro проучванията са полезни за сравняване на ефективността на различните сребърни технологии, важно е също така да се разберат ефектите на тези превръзки върху биофилмите in vivo, където тъканните и имунните отговори на гостоприемника допринасят за ефективността на превръзките срещу биофилмите. Ефектът на тези превръзки върху раневите биофилми е наблюдаван с помощта на сканираща електронна микроскопия и EPS оцветяване на биофилма с помощта на вътреклетъчни и извънклетъчни ДНК багрила. Установихме, че след 3 дни лечение всички превръзки са ефективни за намаляване на безклетъчната ДНК в рани, инфектирани с биофилм, но превръзката Ag1+ е по-малко ефективна при рани, инфектирани със Staphylococcus aureus. Сканиращата електронна микроскопия също така показа, че значително по-малко бактерии присъстват в рани, третирани със сребърни превръзки, въпреки че това е по-изразено при превръзката с кислородна сребърна сол и превръзката Ag1+ + EDTA/BC в сравнение с превръзката Ag1+. Тези данни показват, че тестваните сребърни превръзки имат различна степен на въздействие върху структурата на биофилма, но нито една от сребърните превръзки не е успяла да елиминира биофилма, което подкрепя необходимостта от холистичен подход към лечението на инфекции на раневите биофилми; използване на сребърни ленти за ръка. Лечението се предшества от физическо почистване, за да се премахне по-голямата част от биофилма.
Хроничните рани често са в състояние на тежко възпаление, като излишните възпалителни клетки остават в раневата тъкан за продължителен период от време, причинявайки увреждане на тъканите и изчерпвайки кислорода, необходим за ефективен клетъчен метаболизъм и функция в раната26. Биофилмите изострят тази враждебна ранева среда, като влияят негативно върху заздравяването по различни начини, включително инхибиране на клетъчната пролиферация и миграция и активиране на провъзпалителни цитокини27. Тъй като сребърните превръзки стават все по-ефективни, е важно да се разбере въздействието им върху раневата среда и заздравяването.
Интересното е, че въпреки че всички сребърни превръзки са повлияли на състава на биофилма, само превръзките с оксидирани сребърни соли са увеличили реепителизацията на тези инфектирани рани. Тези данни потвърждават нашите предишни открития17 и тези на Kalan et al. (2017)28, които демонстрираха добри профили на безопасност и токсичност на оксидираните сребърни соли, тъй като по-ниските концентрации на сребро са били ефективни срещу биофилми.
Настоящото ни проучване подчертава разликите в сребърната технология между антимикробните сребърни превръзки и въздействието на тази технология върху раневата среда и независимото от инфекцията заздравяване. Тези резултати обаче се различават от предишни проучвания, показващи, че превръзката Ag1+ + EDTA/BC подобрява параметрите на заздравяване на увредени заешки уши in vivo. Това обаче може да се дължи на разлики в животинските модели, времената за измерване и методите за приложение на бактерии29. В този случай измерванията на раната са направени 12 дни след нараняването, за да се позволи на активните съставки на превръзката да действат върху биофилма за по-дълъг период от време. Това се подкрепя от проучване, което показва, че клинично инфектираните язви на краката, лекувани с Ag1+ + EDTA/BC, първоначално се увеличават по размер след една седмица лечение, а след това през следващите 3 седмици лечение с Ag1+ + EDTA/BC и в рамките на 4 седмици употреба на неантимикробни лекарства. CMC превръзки за намаляване на размера на язвите30.
Преди това е доказано, че някои форми и концентрации на сребро са цитотоксични in vitro 11, но тези in vitro резултати не винаги водят до нежелани ефекти in vivo. Освен това, напредъкът в технологията за сребро и по-доброто разбиране на сребърните съединения и концентрациите им в превръзките са довели до разработването на много безопасни и ефективни сребърни превръзки. С напредването на технологията за сребърни превръзки обаче е важно да се разбере въздействието на тези превръзки върху раневата среда 31, 32, 33. По-рано беше съобщено, че повишената скорост на реепителизация съответства на увеличен дял на противовъзпалителни M2 макрофаги в сравнение с провъзпалителния M1 фенотип. Това беше отбелязано в предишен миши модел, където превръзки за рани от сребърен хидрогел са били сравнени със сребърен сулфадиазин и неантимикробни хидрогелове 34.
Хроничните рани могат да проявяват прекомерно възпаление и е наблюдавано, че наличието на излишък от неутрофили може да е вредно за заздравяването на рани35. В проучване при мишки с намален брой неутрофили, наличието на неутрофили забавя реепителизацията. Наличието на излишък от неутрофили води до високи нива на протеази и реактивни кислородни видове, като супероксид и водороден пероксид, които са свързани с хронични и бавно заздравяващи рани37,38. По същия начин, увеличаването на броя на макрофагите, ако е неконтролирано, може да доведе до забавено заздравяване на рани39. Това увеличение е особено важно, ако макрофагите не са в състояние да преминат от провъзпалителен фенотип към про-заздравяващ фенотип, което води до това раните да не излязат от възпалителната фаза на заздравяване40. Наблюдавахме намаляване на неутрофилите и макрофагите в рани, инфектирани с биофилм, след 3 дни лечение с всички сребърни превръзки, но намалението беше по-изразено при превръзките с кислородна сол. Това намаление може да е пряк резултат от имунния отговор към среброто, отговор на намаленото бионатоварване или раната е в по-късен етап на заздравяване и следователно имунните клетки в раната са намалени. Намаляването на броя на възпалителните клетки в раната може да поддържа среда, благоприятстваща за заздравяването на рани. Механизмът на действие на това как сребърните оксисоли насърчават заздравяването, независимо от инфекцията, е неясен, но способността на сребърните оксисоли да произвеждат кислород и да унищожават вредните нива на водороден пероксид, медиатор на възпалението, може да обясни това и изисква по-нататъшно проучване17.
Хроничните незарастващи инфектирани рани представляват проблем както за лекарите, така и за пациентите. Въпреки че много превръзки твърдят, че са антимикробни, изследванията рядко се фокусират върху други ключови фактори, влияещи върху микросредата на раната. Това проучване показва, че различните сребърни технологии имат различна антимикробна ефикасност и, което е важно, различни ефекти върху средата на раната и заздравяването, независимо от инфекцията. Въпреки че тези in vitro и in vivo проучвания показват ефективността на тези превръзки при лечение на раневи инфекции и насърчаване на заздравяването, са необходими рандомизирани контролирани проучвания, за да се оцени ефективността на тези превръзки в клиниката.
Използваните и/или анализирани по време на настоящото проучване набори от данни са достъпни от съответния автор при разумно искане.
Време на публикуване: 15 юли 2024 г.