Благодаря ви, че посетихте Nature.com. Версията на браузъра, която използвате, има ограничена поддръжка на CSS. За най -добри резултати препоръчваме да използвате по -нова версия на вашия браузър (или режим на съвместимост на деактивиране в Internet Explorer). Междувременно, за да гарантираме постоянна поддръжка, ние показваме сайта без стайлинг или JavaScript.
Микробният растеж на раните често се проявява като биофилми, които пречат на заздравяването и са трудни за изкореняване. Новите сребърни превръзки твърдят, че се борят с инфекциите с рани, но ефикасността на антибиофилма им и лечебните ефекти, независими от инфекцията, обикновено не са известни. Използвайки in vitro и in vivo модели на биофилм на Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa, ние отчитаме ефективността на превръзките за генериране на Ag1+ йони; Ag1+ превръзки, съдържащи етилендиаминететраоцетна киселина и бенцетониев хлорид (AG1+/EDTA/BC), и превръзки, съдържащи сребърен нитрат (Ag Oxysalts). , които произвеждат Ag1+, Ag2+ и Ag3+ йони за борба с биофилма на раната и неговия ефект върху заздравяването. Ag1+ превръзките имат минимални ефекти върху биофилма на раната in vitro и при мишки (C57BL/6J). За разлика от тях, оксигенирани Ag соли и Ag1+/EDTA/BC превръзки значително намаляват броя на жизнеспособните бактерии в биофилмите in vitro и демонстрират значително намаляване на бактериалните и EPS компоненти в биофилмите на раната на мишката. Тези превръзки имаха различни ефекти върху заздравяването на заразени с биофилм и небиофилм-заразени рани, с кислородни солни превръзки, които имат по-благоприятни ефекти върху реепителизацията, размера на раната и възпалението в сравнение с контролните лечения и други сребърни превръзки. Различните физикохимични свойства на сребърните превръзки могат да имат различни ефекти върху биофилма и заздравяването на раната и това трябва да се вземе предвид при избора на превръзка за лечение на заразени с биофилм рани.
Хроничните рани се определят като „рани, които не успяват да прогресират през нормалните етапи на заздравяване по подреден и навременен начин“ 1. Хроничните рани създават психологическа, социална и икономическа тежест за пациентите и здравната система. Годишните разходи за NHS за лечение на рани и свързаните с тях коморбидности се оценяват на 8,3 милиарда британски лири през 2017–182 г. Понастоящем хроничните рани също са належащ проблем в Съединените щати, като Medicare оценява годишните разходи за лечение на пациенти с рани на 28,1 - 96,8 милиарда долара.
Инфекцията е основен фактор, предотвратявайки заздравяването на рани. Инфекциите често се проявяват като биофилми, които присъстват в 78% от нелесните хронични рани. Биофилмите се образуват, когато микроорганизмите стават необратимо прикрепени към повърхности, като повърхности на рани, и могат да се агрегират, за да образуват общности на извънклетъчен полимер (EPS). Биофилмът на раната е свързан с повишен възпалителен отговор, водещ до увреждане на тъканите, което може да забави или предотврати заздравяването4. Увеличаването на увреждането на тъканите може да се дължи отчасти на повишената активност на матричните металопротеинази, колагеназата, еластазата и реактивните видове кислород5. Освен това възпалителните клетки и биофилмите самите са високи потребители на кислород и следователно могат да причинят локална тъканна хипоксия, изчерпвайки клетките на жизненоважния кислород, необходими за ефективно възстановяване на тъканите 6.
Зрелите биофилми са силно устойчиви на антимикробни средства, като изискват агресивни стратегии за контрол на биофилмните инфекции, като механично лечение, последвано от ефективно антимикробно лечение. Тъй като биофилмите могат бързо да се регенерират, ефективните антимикробни средства могат да намалят риска от преобразуване след хирургично разрушаване7.
Среброто се използва все повече при антимикробни превръзки и често се използва като лечение на първа линия за хронични заразени рани. Има много налични в търговската мрежа сребърни превръзки, всяка от които съдържа различен сребърен състав, концентрация и основна матрица. Напредъкът в сребърните ленти доведе до разработването на нови сребърни ленти. Металната форма на сребро (Ag0) е инертна; За да постигне антимикробна ефективност, тя трябва да загуби електрон, за да образува йонно сребро (AG1+). Традиционните сребърни превръзки съдържат сребърни съединения или метално сребро, които, когато са изложени на течност, се разлагат да образуват Ag1+ йони. Тези Ag1+ йони реагират с бактериалната клетка, отстранявайки електрони от структурни компоненти или критични процеси, необходими за оцеляване. Патентованата технология доведе до разработването на ново сребърно съединение, Ag оксисалти (сребърен нитрат, AG7NO11), което е включено в превръзките за рани. За разлика от традиционното сребро, разлагането на соли, съдържащи кислород, произвежда състояния на сребро с по-висока валентност (Ag1+, Ag2+и Ag3+). Изследванията in vitro показват, че ниските концентрации на оксигенирани сребърни соли са по -ефективни от единичното йонно сребро (Ag1+) срещу патогенни бактерии като Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus и Escherichia coli8,9. Друг нов тип сребърна превръзка включва допълнителни съставки, а именно етилендиаминететраоцетна киселина (EDTA) и бенцетониев хлорид (BC), за които се съобщава, че са насочени към биофилм EPS и по този начин увеличават проникването на сребро в биофилма. Тези нови сребърни технологии предлагат нови начини за насочване към биофилми на рани. Въпреки това, въздействието на тези антимикробни върху околната среда на раната и независимо от инфекцията е важно, за да се гарантира, че те не създават неблагоприятна среда на раната или забавят заздравяването. Съобщава се за опасения относно in vitro сребърната цитотоксичност с няколко сребърни превръзки10,11. Въпреки това, in vitro цитотоксичността все още не е преведена в in vivo токсичност и няколко Ag1+ превръзки са демонстрирали добър профил на безопасност12.
Тук изследвахме ефективността на карбоксиметилцелулозните превръзки, съдържащи нови сребърни състави срещу биофилм на раната in vitro и in vivo. В допълнение, ефектите на тези превръзки върху имунните отговори и изцелението са независими от инфекцията.
Всички използвани превръзки бяха налични в търговската мрежа. 3M дресинг на Kerracel Gel Fiber (3M, Knutsford, UK) е неантимикробен 100% карбоксиметилцелулозен (CMC) превръзка на гел влакна, която се използва като контролна превръзка в това проучване. Бяха оценени три антимикробни CMC сребърни превръзки, а именно 3M дресинг на Kerracel AG (3M, Knutsford, UK), който съдържа 1,7 тегл.%. Оксигенирана сребърна сол (AG7NO11) в сребърни йони с по -висока валентност (Ag1+, Ag2+и Ag3+). По време на разлагането на Ag7NO11, Ag1+, Ag2+ и Ag3+ йони се образуват в съотношение 1: 2: 4. Aquacel AG допълнителна дресинг, съдържащ 1,2% сребърен хлорид (AG1+) (Convatec, Deeside, UK) 13 и Aquacel AG+допълнителна дресинг, съдържащ 1,2% сребърен хлорид (AG1+), EDTA и бенцетониев хлорид (Convatec, Deeside, UK) 14.
Стомобите, използвани в това проучване, бяха Pseudomonas aeruginosa NCTC 10781 (Public Health England, Salisbury) и Staphylococcus aureus NCTC 6571 (Public Health England, Salisbury).
Бактериите се отглеждат за една нощ в бульон Muller-Hinton (Oxoid, Altrincham, UK). След това културата за една нощ се разрежда 1: 100 в бульон на Мюлер-Хинтон и 200 µl, поставена върху стерилни 0,2 µm Whatman Cyclopore Membranes (Whatman Plc, Maidstone, UK) върху агарните плочи на Мюлер-Хинтон (Sigma-Aldrich Company Ltd, Kent, Великобритания ). ) Формиране на колониален биофилм при 37 ° С в продължение на 24 часа. Тези колониални биофилми бяха тествани за логаритмично свиване.
Нарежете превръзката на 3 cm2 квадратни парчета и предварително Moisten със стерилна дейонизирана вода. Поставете превръзката върху биофилма на колонията на агарната плоча. На всеки 24 ха биофилм се отстранява и жизнеспособните бактерии в биофилма (CFU/mL) се определят количествено чрез серийно разреждане (10-1 до 10-7) в бульон за неутрализиране на дневен ъгъл (Merck-Millipore). След 24 часа инкубация при 37 ° С се извършва стандартни броя на плочите върху агарните плочи на Мюлер-Хинтон. Всяка лечение и времева точка се извършва в три екземпляра и броят на плочите се повтаря за всяко разреждане.
Кожата на свинското коремче се получава от женски големи бели прасета в рамките на 15 минути след клането в съответствие със стандартите за износ на Европейския съюз. Кожата се обръсна и почиства с алкохолни кърпички, след което се замразява при -80 ° С в продължение на 24 часа, за да се девитализира кожата. След размразяване, 1 cm2 парчета кожа се промиват три пъти с PBS, 0,6% натриев хипохлорит и 70% етанол за 20 минути всеки път. Преди да премахнете епидермиса, отстранете всеки останал етанол, като измиете 3 пъти в стерилен PBS. Кожата се култивира в 6-ямкова плоча с найлонова мембрана с дебелина 0,45 µm (Merck-Millipore) отгоре и 3 абсорбиращи подложки (Merck-Millipore), съдържащи 3 ml фетален говежди серум (Sigma), допълнен с 10% модифициран на Dulbecco модифициран серум Орел. Среден (модифициран орел на Dulbecco - Aldrich Ltd.).
Колониалните биофилми се отглеждат, както е описано за проучвания за експозиция на биофилм. След култивиране на биофилма на мембраната в продължение на 72 часа, биофилмът се прилага върху повърхността на кожата с помощта на стерилен контур за инокулация и мембраната се отстранява. След това биофилмът се инкубира върху дермата на прасета за допълнителни 24 часа при 37 ° С, за да може биофилмът да узрее и да се придържа към кожата на свинете. След като биофилмът узрява и прикрепи, превръзка с 1,5 cm2, предварително монтирана със стерилна дестилирана вода, се прилага директно върху повърхността на кожата и се инкубира при 37 ° С в продължение на 24 часа. Жизнеспособните бактерии се визуализират чрез оцветяване чрез равномерно прилагане на реагент на жизнеспособността на престола (Invitrogen, Life Technologies, Paisley, UK) към апикалната повърхност на всяко обяснение и го инкубират в продължение на 5 минути. Използвайте цифровия фотоапарат Leica DFC425, за да заснемете незабавно изображения на микроскопа Leica MZ8. Оцветените в области Pink бяха количествено определени с помощта на Image Pro Software Версия 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD Image-Pro (MediaCy.com)). Сканиращата електронна микроскопия се извършва, както е описано по -долу.
Бактериите, отглеждани за една нощ, се разреждат 1: 100 в бульон Мюлер-Хинтон. 200 μl култура се добавя към стерилна 0,2 μm Whatman Cyclopore Membrane (Whatman, Maidstone, UK) и се поставя върху агар на Mueller-Hinton. Биофилмните плаки се инкубират при 37 ° С в продължение на 72 часа, за да се позволи образуване на зрял биофилм.
След 3 дни узряване на биофилма, 3 cm2 квадратна превръзка се поставя директно върху биофилма и се инкубира при 37 ° C за 24 часа. След отстраняване на превръзката от повърхността на биофилма се добавя 1 ml реагент на жизнеспособността на престола на клетките (Invitrogen, Waltham, MA) към повърхността на всеки биофилм за 20 секунди. Повърхностите се изсушават, преди да бъдат записани промени в цвета с помощта на цифров фотоапарат Nikon D2300 (Nikon UK Ltd., Kingston, UK).
Пригответе култури за една нощ върху агар на Мюлер-Хинтон, прехвърлете отделни колонии на 10 ml бульон Mueller-Hinton и инкубирайте на шейкър при 37 ° С (100 об / мин). After overnight incubation, the culture was diluted 1:100 in Mueller-Hinton broth and 300 µl was spotted onto 0.2 µm circular Whatman cyclopore membrane (Whatman International, Maidstone, UK) on Mueller-Hinton agar and incubated at 37°C within 72 hours . . Зрелият биофилм се прилага върху раната, както е описано по -долу.
Цялата работа с животни е извършена в Манчестърския университет съгласно лиценз за проект, одобрен от Службата за хуманно отношение към животните и етичния преглед (P8721BD27) и в съответствие с насоките, публикувани от домашния офис по ревизирания ASPA за 2012 г. Всички автори се придържат към насоките за пристигане. Осемседмични C57BL/6J мишки (Envigo, Oxon, UK) са използвани за всички in vivo проучвания. Мишките бяха анестезирани с изофлуран (Piramal Critical Care Ltd, West Drayton, UK) и гръбните им повърхности бяха обръснати и почистени. След това на всяка мишка получи 2 × 6 mm ексцизионна рана с помощта на Phuepsy BioPsy Punch (Schuco International, Hertfordshire, UK). За заразени с биофилм рани нанесете 72-часов колониален биофилм, отглеждан върху мембраната, както е описано по-горе, към дермалния слой на раната, като се използва стерилен контур на инокулация веднага след нараняване и изхвърлете мембраната. Един квадратен сантиметър на обличането се предразполага със стерилна вода, за да се поддържа влажна среда на раната. Облесителите се прилагат директно върху всяка рана и се покриват с 3M Tegaderm филм (3M, Bracknell, UK) и мастизол течно лепило (красноречиво здравеопазване, Ferndale, MI), приложени около краищата, за да осигурят допълнителна адхезия. Бупренорфин (Animalcare, Йорк, Великобритания) се прилага при концентрация от 0,1 mg/kg като аналгетик. Съхранявайте мишки три дни след нараняване, използвайки метода на списък 1 и извадете, намалете наполовина и съхранявайте областта на раната, ако е необходимо.
Хематоксилин (Thermofisher Scientific) и Eosin (Thermofisher Scientific) се извършват съгласно протокола на производителя. Площта на раната и реепителизацията бяха количествено определени с помощта на софтуер на Image Pro Версия 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD).
Тъканните участъци бяха обезмаслени в ксилол (Thermofisher Scientific, Loughborough, UK), рехидратирани със 100–50% степенуван етанол и за кратко се потапят в дейонизирана вода (Thermofisher Scientific). Имунохистохимията се извършва с помощта на комплекта Vectastain Elite ABC PK-6104 (Vector Laboratories, Burlingame, CA) съгласно протокола на производителя. Първични антитела към неутрофили NIMP-R14 (Thermofisher Scientific) и макрофаги MS CD107b Pure M3/84 (BD Biosciences, Wokingham, UK) се разреждат 1: 100 в блокиращ разтвор и се добавят към изрязаната повърхност, последвани от 2 антитела анти-, ветастайн ABC и Vector Nova Red Peroxidase (HRP) комплект за субстрат (Vector Laboratories, Burlingame, CA) и противопоставени с хематоксилин. Изображенията са придобити с помощта на микроскоп Olympus BX43 и цифров фотоапарат Olympus DP73 (Olympus, Southend-on-Sea, UK).
Кожните проби се фиксират в 2,5% глутаралдехид и 4% формалдехид в 0,1 М HEPE (рН 7,4) в продължение на 24 часа при 4 ° С. Пробите се дехидратират с помощта на степенуван етанол и се изсушават в CO2, използвайки кворум K850 Drity Point сушилня (Quorum Technologies Ltd, Loughton, UK) и разпръснато, покрито със злато-паладий сплав с помощта на Quorum SC7620 Mini Sputterer/Glow Distrest System. Екземплярите се изобразяват с помощта на FEI Quanta 250 сканиращ електронен микроскоп (Thermofisher Scientific), за да се визуализира централната точка на раната.
TOTO-1 йодид (2 µM) се прилага върху повърхността на изрязаната миши и се инкубира в продължение на 5 минути при 37 ° С (Thermofisher Scientific) и се третира с SYTO-60 (10 μm) при 37 ° С (Thermofisher Scientific). 15-минутни Z-стекови изображения са създадени с помощта на Leica TCS SP8.
Данните за биологични и технически реплики бяха таблицирани и анализирани с помощта на софтуера GraphPad Prism V9 (GraphPad Software, La Jolla, CA). Еднопосочен анализ на дисперсията с множество сравнения, използвайки пост-хок теста на Dunnett, беше използван за тестване за разлики между всяко лечение и неантимикробната контролна превръзка. Стойност на P <0,05 се счита за значителна.
Ефективността на фиброзните превръзки със сребърен гел първо се оценява срещу биофилмните колонии на Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa in vitro. Сребърните превръзки съдържат различни формули на сребро: Традиционните сребърни превръзки произвеждат Ag1+ йони; Сребърните превръзки, които могат да произвеждат Ag1+ йони след добавянето на EDTA/BC, могат да унищожат матрицата на биофилма и да изложат бактериите на сребро под антибактериалния ефект на среброто. йони15 и превръзки, съдържащи кислородна AG соли, които произвеждат Ag1+, Ag2+ и Ag3+ йони. Ефективността му беше сравнена с неантимикробния контрол на контрола, направен от желирани влакна. Останалите жизнеспособни бактерии в рамките на биофилма се оценяват на всеки 24 часа в продължение на 8 дни (Фигура 1). На 5 -ия ден биофилмът се ренокулира с 3.85 × 105s. Staphylococcus aureus или 1.22 × 105p. Aeruginosa за оценка на възстановяването на биофилма. В сравнение с неантимикробни контролни превръзки, Ag1+ превръзките имат минимален ефект върху бактериалната жизнеспособност в биофилмите Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa за 5 дни. За разлика от това, превръзките, съдържащи оксигенирани Ag и Ag1 + + EDTA/BC соли, са били ефективни при убиване на бактерии в рамките на биофилма в рамките на 5 дни. След многократна инокулация с планктонни бактерии на 5 -ти ден, не се наблюдава възстановяване на биофилма (фиг. 1).
Количествено определяне на жизнеспособни бактерии в биофилмите на Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa след лечение със сребърни превръзки. Колониите на биофилм на Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa бяха третирани със сребърни превръзки или неантимикробни контролни превръзки и броят на оставащите жизнеспособни бактерии се определя на всеки 24 часа. След 5 дни биофилмът се ренокулира с 3.85 × 105s. Staphylococcus aureus или 1.22 × 105p. Колониите на бактериопланктона Pseudomonas aeruginosa се образуват индивидуално за оценка на възстановяването на биофилма. Графиките показват средно +/- Стандартна грешка.
За да се визуализира ефекта на сребърните превръзки върху жизнеспособността на биофилма, превръзките се прилагат за зрели биофилми, отглеждани върху свинска кожа ex vivo. След 24 часа превръзката се отстранява и биофилмът се оцветява със синьо реактивно багрило, което се метаболизира чрез живи бактерии до розов цвят. Биофилмите, третирани с контролни превръзки, са розови, което показва наличието на жизнеспособни бактерии в биофилма (Фигура 2А). За разлика от тях, биофилмът, третиран с обличането на Ag оксизоли, е предимно синьо, което показва, че останалите бактерии на повърхността на кожата на свинете са нежизнеспособни бактерии (Фигура 2В). Смесено синьо и розово оцветяване се наблюдава при биофилми, третирани с Ag1+-съдържащи превръзки, което показва наличието на жизнеспособни и нежизнеспособни бактерии в биофилма (Фигура 2в), докато дресиите на EDTA/BC, съдържащи Ag1+, бяха предимно сини с някои розови петна. показващи зони, които не са засегнати от сребърната превръзка (Фигура 2г). Количественото определяне на активни (розови) и неактивни (сини) области показа, че контролната пластир е 75% активен (Фигура 2Е). Ag1 + + EDTA/BC превръзки се изпълняваха подобно на оксигенирани Ag солни превръзки, като процентът на оцеляване съответно 13% и 14%. Осъщественият Ag1+ също намалява бактериалната жизнеспособност с 21%. След това тези биофилми се наблюдават с помощта на сканираща електронна микроскопия (SEM). След третиране с контролната превръзка и обличането Ag1+ се наблюдава слой от псевдомонас аеригиноза, покриващ свинската кожа (Фигура 2F, Н), докато след лечение с Ag1+ дресинг са открити малко бактериални клетки и са открити малко бактериални клетки отдолу. Колагенните влакна могат да се считат за тъканната структура на свинската кожа (Фигура 2G). След третиране с AG1 + + EDTA/BC дресинг, бактериални плаки и основни плаки на колагенни влакна (Фигура 2I).
Визуализация на биофилма на Pseudomonas aeruginosa след третиране на сребърния дресинг. (A-D) Бактериалната жизнеспособност в биофилмите на Pseudomonas aeruginosa, отглеждани върху свинската кожа, се визуализира, като се използва багрило за жизнеспособност на PrestoBlue 24 часа след лечение със сребърни превръзки или неантимикробни контролни превръзки. Живите бактерии са розови, нежизнеспособни бактерии, а свинска кожа са сини. (E) Количествено определяне на биофилмите на Pseudomonas aeruginosa, отглеждани на свинска кожа (розово петно), използвайки сканираща електронна микроскопия PRO версия 10 (FI) и третирани със сребърна превръзка или неантимикробно контролно превръзка в продължение на 24 часа. SEM мащабна лента = 5 µm. (J - M) Колониалните биофилми растат на филтри и се оцветяват с престолуещо реактивно багрило след 24 часа инкубация със сребърни превръзки.
За да се определи дали близък контакт между превръзките и биофилмите се отрази върху ефективността на превръзките, колониалните биофилми, поставени върху равна повърхност, се обработват с превръзките в продължение на 24 часа и след това се оцветяват с реактивни багрила. Нетретираният биофилм беше тъмно розов на цвят (Фигура 2J). За разлика от биофилмите, третирани с превръзки, съдържащи оксигенирани Ag соли (Фигура 2K), биофилмите, третирани с превръзки, съдържащи Ag1+ или Ag1++ EDTA/BC, показват ленти от розово оцветяване (Фигура 2L, M). Това розово оцветяване показва наличието на жизнеспособни бактерии и е свързано с зоната на шева в рамките на превръзката. Тези пришити зони създават мъртви пространства, които позволяват на бактериите в биофилма да оцелеят.
За да се оцени ефективността на сребърните дресинги in vivo, изрязаните рани на мишки, заразени със зрели S. aureus и P. aeruginosa биофилми, се лекуват с неантимикробни контролни превръзки или сребърни превръзки. След 3 дни лечение, макроскопският анализ на изображенията показва по-малки размери на раните, когато се лекува с оксигенирани солени превръзки в сравнение с неантимикробни контролни превръзки и други сребърни превръзки (Фигура 3А-Н). За да се потвърди тези наблюдения, раните се събират и областта на раната и репителизализацията се определят количествено върху оцветени с хематоксилин и еозин тъканни участъци, използвайки софтуер на Image Pro Версия 10 (Фигура 3I-L).
Ефектът на сребърните превръзки върху повърхността на раната и повторно епителизация на рани, заразени с биофилми. (A - H) Малки клетки, заразени с биофилми на Pseudomonas aeruginosa (A - D) и Staphylococcus aureus (E - H) след три дни лечение с неантимикробен контрол на превръзка, оксигениран Ag сол, Ag1+ превръзка и AG1++ обличане. Представителни макроскопски изображения. Рани на мишки с Ag1 + + EDTA/BC дресинг. (IL) Представителна инфекция с Pseudomonas aeruginosa, хистологични участъци, оцветени с хематоксилин и еозин, използвани за количествено определяне на областта на раната и регенерацията на епител. Количествено определяне на площта на раната (M, O) и процентната реепителизация (N, P) на рани, заразени с Pseudomonas aeruginosa (M, N) и Staphylococcus aureus (O, P) биофилми (за лечение N = 12). Графиките показват средно +/- Стандартна грешка. * означава p = <0,05 ** означава p = <0,01; Макроскопска скала = 2,5 mm, хистологична скала = 500 µm.
Количествено определяне на площта на раната при рани, заразени с биофилм Pseudomonas aeruginosa (Фигура 3M), показва, че раните, лекувани с Ag оксисалти Вярно. достигна статистическа значимост (Фигура 3M). P = 0,423). Раните, лекувани с Ag1+ или Ag1++ EDTA/BC, не показват намаляване на областта на раната (съответно 3,1 mm2 и 3,6 mm2). Лечението с оксигенирана Ag солна превръзка насърчава реепителизацията в по-голяма степен от не-антимикробния контрол на контрола (съответно 34% и 15%; P = 0,029) и Ag1+ или Ag1++ EDTA/BC (10% и 11%) ( Фигура 3n). . , съответно).
Подобни тенденции в областта на раната и епителната регенерация са наблюдавани при рани, заразени с биофилми на S. aureus (Фигура 3O). Облеси, съдържащи оксигенирани сребърни соли, намаляват площта на раната (2,0 mm2) с 23% в сравнение с контролната нентимикробна превръзка (2.6 mm2), въпреки че това намаление не е значително (P = 0,304) (фиг. 3O). В допълнение, областта на раната в групата AG1+ лечение е леко намалена (2,4 mm2), докато раната, третирана с Ag1++ EDTA/BC, не намалява областта на раната (2,9 mm2). Кислородните соли на Ag също насърчават повторното епителизация на рани, заразени с биофилм S. aureus (31%) в по-голяма степен от тези, лекувани с неантимикробни контролни превръзки (12%, p = 0,003) (Фигура 3p). Ag1+ превръзка (16%, P = 0,903) и AG+ 1+ EDTA/BC дресинг (14%, P = 0,965) показват нива на епителна регенерация, подобни на контрола.
За да се визуализира ефекта на сребърните дресинги върху матрицата на биофилма, беше извършено оцветяване на TOTO 1 и SYTO 60 (фиг. 4). TOTO 1 йодид е клетъчно-непропустимо багрило, което може да се използва за точно визуализиране на извънклетъчните нуклеинови киселини, които са в изобилие в EPS на биофилмите. SYTO 60 е клетъчна пропусклива багрила, използвана като контраст16. Наблюдения на TOTO 1 и SYTO 60 йодид при рани, инокулирани с биофилми на Pseudomonas aeruginosa (Фигура 4A-D) и Staphylococcus aureus (Фигура 4I-L), показват, че след 3 дни обличане, EPS в биофилма е значително намален. съдържащи кислородни соли AG и AG1 + + EDTA/BC. Ag1+ превръзки без допълнителни компоненти на антибиофилма значително намаляват безклетъчната ДНК при рани, инокулирани с Pseudomonas aeruginosa, но са по-малко ефективни при рани, инокулирани със Staphylococcus aureus.
In vivo изображения на биофилм на раната след 3 дни лечение с контролни или сребърни превръзки. Конфокални изображения на Pseudomonas aeruginosa (A - D) и Staphylococcus aureus (I - L), оцветени с TOTO 1 (зелен) за визуализиране на извънклетъчните нуклеинови киселини, компонент на извънклетъчните биофилмски полимери. За да оцветявате вътреклетъчните нуклеинови киселини, използвайте SYTO 60 (червено). киселини. P. Сканираща електронна микроскопия на рани, заразени с Pseudomonas aeruginosa (E - H) и Biofilms Staphylococcus aureus (M - P) след 3 дни лечение с контролни и сребърни превръзки. SEM мащабна лента = 5 µm. Конфокална скала за изображения = 50 µm.
Сканиращата електронна микроскопия показва, че мишки, инокулирани с колонии от биофилм на Pseudomonas aeruginosa (Фигура 4е-Н) и Staphylococcus aureus (Фигура 4M-P), имат значително по-малко бактерии в раните си след 3 дни лечение с всички сребърни превръзки.
За да се оцени ефекта на сребърните превръзки върху възпалението на раната при заразени с биофилм мишки, секции от заразени с биофилм рани, лекувани с контролни или сребърни превръзки в продължение на 3 дни, са имунохистохимично оцветени с помощта на антитела, специфични за неутрофили и макрофаги. Количествено определяне на неутрофилите и макрофагите вътрешно. гранулационна тъкан. Фигура 5). Всички сребърни превръзки намалиха броя на неутрофилите и макрофагите в рани, заразени с Pseudomonas aeruginosa в сравнение с неантимикробни контролни превръзки след три дни лечение. Въпреки това, третирането с оксигенирана сребърна солена дресинг води до по -голямо намаляване на неутрофилите (P = <0,0001) и макрофагите (P = <0,0001) в сравнение с други тествани сребърни превръзки (Фигура 5i, J). Въпреки че AG1++ EDTA/BC има по -голям ефект върху биофилма на раната, той намалява нивата на неутрофил и макрофагите в по -малка степен от обличането Ag1+. Умерените рани, заразени с биофилма на S. aureus, също се наблюдават след обличане с Ag (P = <0,0001), Ag1+ (P = 0,0008) и Ag1 ++ EDTA/BC (P = 0,0043) оксизоли в сравнение с контрола. Подобни тенденции се наблюдават при неутропения. превръзка (фиг. 5K). Въпреки това, само оксигенираната Ag солна превръзка показва значително намаляване на броя на макрофагите в гранулационната тъкан в сравнение с контрола при рани, заразени с биофилми на S. aureus (P = 0,0339) (Фигура 5L).
Неутрофилите и макрофагите се определят количествено в рани, заразени с Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus биофилми след 3 дни лечение с неантимикробен контрол или сребърни превръзки. Неутрофилите (AD) и макрофагите (EH) се определят количествено в тъканни участъци, оцветени с антитела, специфични за неутрофили или макрофаги. Количествено определяне на неутрофилите (I и K) и макрофагите (J и L) при рани, заразени с Pseudomonas aeruginosa (I и J) и Staphylococcus aureus (K&L) биофилми. N = 12 на група. Графиките показват средно +/- Стандартна грешка, стойности на значимостта в сравнение с неантибактериалната контролна превръзка, * означава P = <0,05, ** означава P = <0,01; *** означава p = <0,001; показва p = <0,0001).
След това оценихме ефекта на сребърните превръзки върху независимо от инфекцията изцеление. Неинфектирани ексцизионни рани се лекуват с неантимикробно контролно превръзка или сребърна превръзка в продължение на 3 дни (Фигура 6). Сред тестваните сребърни превръзки само рани, лекувани с оксигенирана сол, изглеждаха по-малки при макроскопични изображения, отколкото рани, лекувани с контрола (Фигура 6А-D). Количественото определяне на площта на раната, използвайки хистологичен анализ, показва, че средната площ на раната след лечение с обличането на Ag оксизоли е 2,35 mm2 в сравнение с 2,96 mm2 за рани, лекувани с контролната група, но тази разлика не достига статистическа значимост (p = 0,488) (фиг. . За разлика от тях, не се наблюдава намаляване на областта на раната след третиране с Ag1+ (3,38 mm2, p = 0,757) или AG1++ EDTA/BC (4.18 mm2, P = 0,054) превръзки в сравнение с контролната група. Наблюдава се повишена регенерация на епител при Ag оксисолната превръзка в сравнение с контролната група (съответно 30% срещу 22%), въпреки че това не достига значимост (p = 0,067), това е доста значително и потвърждава предишни резултати. Осъществяване с оксизоли насърчава повторната епителизация. -Пепителизация на неинфектирани рани17. За разлика от това, лечението с Ag1+ или Ag1++ EDTA/BC дресинг няма ефект или показа намалена репорозализация в сравнение с контрола.
Ефект на сребърната превръзка на рани върху заздравяването на рани при неинфектирани мишки с пълна резекция. (AD) Представителни макроскопични изображения на рани след три дни лечение с неантимикробно контролно превръзка и сребърна превръзка. (EH) Представителни участъци с рани, оцветени с хематоксилин и еозин. Количественото определяне на площта на раната (I) и процентът на реепителизацията (J) се изчисляват от хистологични секции в средната точка на раната, използвайки софтуер за анализ на изображения (n = 11–12 на група за лечение). Графиките показват средно +/- Стандартна грешка. * означава P = <0,05.
Среброто има дълга анамнеза за употреба като антимикробна терапия при заздравяване на рани, но многото различни състави и методи за доставяне могат да доведат до разлики в антимикробната ефикасност 18. Освен това, свойствата на антибиофилма на специфични системи за доставяне на сребро не са напълно разбрани. Въпреки че имунният отговор на гостоприемника е сравнително ефективен срещу планктонните бактерии, той обикновено е по -малко ефективен срещу Biofilms19. Планктонните бактерии лесно се фагоцитират от макрофаги, но в рамките на биофилмите, агрегираните клетки създават допълнителни проблеми, като ограничават отговора на гостоприемника до степента, в която имунните клетки могат да претърпят апоптоза и да освободят провъзпалителни фактори за повишаване на имунния отговор20. Забелязано е, че някои левкоцити могат да проникнат в Biofilms21, но не са в състояние да фагоцитозни бактерии, след като тази защита е компрометирана22. Трябва да се използва цялостен подход за подпомагане на имунния отговор на гостоприемника срещу инфекция с биофилм на раната. Дебитирането на раната може физически да наруши биофилма и да премахне по -голямата част от биобурден, но имунният отговор на гостоприемника може да бъде неефективен спрямо оставащия биофилм, особено ако имунният отговор на гостоприемника е компрометиран. По този начин, антимикробните терапии като сребърни превръзки могат да подкрепят имунния отговор на гостоприемника и да елиминират инфекциите с биофилм. Съставът, концентрацията, разтворимостта и субстрата за доставка могат да повлияят на антимикробната ефективност на среброто. През последните години напредъкът в технологията за обработка на сребро направи тези превръзки по -ефективни 9,23. С напредването на сребърната технология за превръзка е важно да се разбере ефективността на тези превръзки при контролирането на инфекцията на раната и по -важното - въздействието на тези мощни форми на сребро върху околната среда на раната и заздравяването.
В това проучване сравнихме ефективността на две напреднали сребърни превръзки с конвенционални сребърни превръзки, които произвеждат Ag1+ йони срещу биофилми, използвайки различни in vitro и in vivo модели. Ние също така оценихме ефекта от тези превръзки върху околната среда на раната и независимо от инфекцията заздравяване. За да се сведе до минимум влиянието на матрицата за доставка, всички тествани сребърни превръзки са съставени от карбоксиметилцелулоза.
Our preliminary evaluation of these silver dressings against colonial biofilms of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus shows that, unlike traditional Ag1+ dressings, two advanced silver dressings, Ag1+ + EDTA/BC and oxygenated Ag salts, are effective at 5. Effectively killing biofilm bacteria in within Няколко дни. В допълнение, тези превръзки предотвратяват преобразуване на биофилма при многократно излагане на планктонови бактерии. АГ1+ превръзката съдържа сребърен хлорид, същото сребърно съединение и основна матрица като AG1++ EDTA/BC и има ограничен ефект върху бактериалната жизнеспособност в биофилма за същия период. Наблюдението, че AG1++ EDTA/BC превръзка е по -ефективно срещу биофилма, отколкото Ag1+ превръзка, състояща се от една и съща матрица и сребърно съединение подкрепя идеята, че са необходими допълнителни съставки за повишаване на ефективността на сребърния хлорид срещу биофилма, както е съобщено, че е съобщено другаде15. Тези резултати подкрепят идеята, че BC и EDTA играят допълнителна роля, допринасяща за цялостната ефективност на превръзката и че липсата на този компонент в Ag1+ превръзки може да допринесе за неуспеха да се демонстрира in vitro ефикасност. Установихме, че оксигенирани Ag солни превръзки, произвеждащи Ag2+ и Ag3+ йони, показват по -силна антибактериална ефективност в сравнение с Ag1+ и при нива, подобни на AG1++ EDTA/BC. Поради високия редокс потенциал обаче не е ясно колко дълго Ag3+ йони остават активни и ефективни срещу биофилмите на раната и следователно заслужават допълнително проучване. Освен това има много различни превръзки, които генерират Ag1+ йони, които не са тествани в това проучване. Тези превръзки са съставени от различни сребърни съединения, концентрации и основни матрици, които могат да повлияят на доставката на Ag1+ йони и тяхната ефективност спрямо биофилмите. Също така си струва да се отбележи, че има много различни модели in vitro и in vivo, използвани за оценка на ефективността на превръзките за рани срещу биофилмите. Типът на използвания модел, както и съдържанието на сол и протеини в медиите, използвани в тези модели, ще повлияят на ефективността на превръзката. В нашия in vivo модел ние позволихме на биофилма да узрее in vitro и след това го прехвърлихме на дермалната повърхност на раната. Имунният отговор на мишката на гостоприемника е сравнително ефективен срещу планктонни бактерии, приложени към раната, като по този начин образува биофилм, докато раната лекува. Добавянето на зрял биофилм към рана ограничава ефективността на имунния отговор на гостоприемника към образуването на биофилм, като позволява на зрелия биофилм да се установи в раната, преди да започне заздравяване. По този начин, нашият модел ни позволява да оценяваме ефективността на антимикробните превръзки върху зрелите биофилми, преди да започнат рани да лекуват.
Установихме също, че обличането Fit повлия на ефективността на сребърните превръзки върху биофилмите, отглеждани in vitro и свинската кожа. Близкият контакт с раната се счита за критичен за антимикробната ефективност на превръзката24,25. Облесителите, съдържащи оксигенирани Ag соли, бяха в тесен контакт със зрели биофилми, което води до значително намаляване на броя на жизнеспособните бактерии в рамките на биофилма след 24 часа. За разлика от тях, когато се лекуват с Ag1+ и Ag1++ EDTA/BC превръзки, остават значителен брой жизнеспособни бактерии. Тези превръзки съдържат шевове по цялата дължина на превръзката, която създава мъртви пространства, които предотвратяват тесен контакт с биофилма. В нашите in vitro проучвания тези безконтактни области предотвратяват убийството на жизнеспособни бактерии в биофилма. Ние оценихме бактериалната жизнеспособност само след 24 часа лечение; С течение на времето, тъй като превръзката става по -наситена, може да има по -малко мъртво пространство, намалявайки площта за тези жизнеспособни бактерии. Това обаче подчертава значението на състава на превръзката, а не само вида на среброто в превръзката.
Докато проучванията in vitro са полезни за сравняване на ефективността на различните сребърни технологии, също така е важно да се разберат ефектите на тези превръзки върху биофилмите in vivo, където тъканите на гостоприемника и имунните реакции допринасят за ефективността на превръзките срещу биофилмите. Ефектът от тези превръзки върху биофилмите на раната се наблюдава с помощта на сканираща електронна микроскопия и EPS оцветяване на биофилма с помощта на вътреклетъчни и извънклетъчни ДНК багрила. Установихме, че след 3 дни лечение, всички превръзки са били ефективни за намаляване на безклетъчната ДНК при заразени с биофилм рани, но превръзката Ag1+ е по-малко ефективна при заразени с стафилокок ауреус. Сканиращата електронна микроскопия също показва, че значително по -малко бактерии присъстват при рани, третирани със сребърните превръзки, въпреки че това е по -изразено с оксигенираната Ag солна превръзка и дресинга Ag1++ EDTA/BC в сравнение с дресинга Ag1+. Тези данни показват, че тестваните сребърни превръзки са имали различна степен на въздействие върху структурата на биофилма, но никой от сребърните превръзки не е бил в състояние да изкорени биофилма, подкрепяйки необходимостта от цялостен подход за лечение на инфекции с биофилм на раната; Използване на сребърни ленти. Лечението е предшествано от физическо разрушаване за отстраняване на по -голямата част от биофилма.
Хроничните рани често са в състояние на тежко възпаление, като излишните възпалителни клетки остават в тъканта на раната за продължителен период от време, причинявайки увреждане на тъканите и изчерпване на кислорода, необходим за ефективен клетъчен метаболизъм и функция при раната26. Биофилмите изострят тази враждебна среда на раната, като отрицателно влияят на заздравяването по различни начини, включително инхибиране на клетъчната пролиферация и миграция и активиране на провъзпалителни цитокини27. Тъй като сребърните превръзки стават по -ефективни, важно е да се разбере въздействието, което оказват върху околната среда на раната и изцелението.
Интересното е, че въпреки че всички сребърни превръзки повлияха на състава на биофилма, само оксигенирани сребърни солни превръзки повишават повторно епителизацията на тези заразени рани. Тези данни подкрепят предишните ни открития17 и тези на Kalan et al. (2017) 28, който демонстрира добри профили на безопасност и токсичност на оксигенирани сребърни соли, тъй като по -ниските концентрации на сребро са ефективни срещу биофилмите.
Нашето настоящо проучване подчертава разликите в сребърната технология между антимикробните сребърни превръзки и въздействието на тази технология върху околната среда на раната и независимо от инфекцията. Тези резултати обаче се различават от предишни проучвания, показващи, че превръзката Ag1 + + EDTA/BC подобрява лечебните параметри на ранени заешки уши in vivo. Това обаче може да се дължи на разликите в животинските модели, времето за измерване и методите на бактериално приложение29. В този случай измерванията на рани са направени 12 дни след нараняване, за да се позволи активните съставки на превръзката да действат върху биофилма за по -дълъг период от време. Това се подкрепя от проучване, което показва, че клинично заразените язви на краката, лекувани с Ag1 + + EDTA/BC, първоначално се увеличават по размер след една седмица лечение, а след това през следващите 3 седмици лечение с AG1 + + EDTA/BC и в рамките на 4 седмици от Използване на неантимикробни. лекарства. CMC превръзки за намаляване на размера на ULCERS30.
Определени форми и концентрации на сребро преди това са показани като цитотоксични in vitro 11, но тези in vitro резултати не винаги се превръщат в неблагоприятни ефекти in vivo. В допълнение, напредъкът в сребърната технология и по -доброто разбиране на сребърните съединения и концентрациите в превръзките доведоха до развитието на много безопасни и ефективни сребърни превръзки. С напредването на технологията за сребърна обличане обаче е важно да се разбере въздействието на тези превръзки върху околната среда на раната 31,32,33. По-рано беше съобщено, че повишената скорост на реепителизация съответства на повишен дял на противовъзпалителните М2 макрофаги в сравнение с провъзпалителния М1 фенотип. Това беше отбелязано в предишен модел на мишка, при който сребърните превръзки за рани от хидрогел бяха сравнени със сребърен сулфадиазин и неантимикробни хидрогели34.
Хроничните рани могат да проявяват прекомерно възпаление и е забелязано, че наличието на излишни неутрофили може да бъде пагубно за заздравяването на рани35. В проучване при мишки, изчерпани с неутрофили, присъствието на неутрофили забави реепителизацията. Наличието на излишни неутрофили води до високи нива на протеази и реактивни видове кислород, като супероксид и водороден пероксид, които са свързани с хронични и бавно лечебни рани37,38. По същия начин, увеличаването на броя на макрофагите, ако не е неконтролирано, може да доведе до забавено заздравяване на рани39. Това увеличение е особено важно, ако макрофагите не са в състояние да преминат от провъзпалителен фенотип към пролегиращ фенотип, което води до това, че раните не успяват да излязат от възпалителната фаза на заздравяването40. Наблюдавахме намаляване на неутрофилите и макрофагите в заразени с биофилм рани след 3 дни лечение с всички сребърни превръзки, но намаляването беше по-изразено с оксигенирани солни превръзки. Това намаление може да бъде пряк резултат от имунния отговор на сребро, отговор на намален биобурден или раната е в по -късен стадий на заздравяване и следователно имунните клетки в раната се намаляват. Намаляването на броя на възпалителните клетки в раната може да поддържа среда, благоприятна за заздравяване на рани. Механизмът на действие за това как Ag оксисалтите насърчават заздравяването, независимо от инфекцията, е неясен, но способността на Ag оксисалтите да произвеждат кислород и да унищожат вредните нива на водороден пероксид, медиатор на възпалението, може да обясни това и изисква допълнително изследване17.
Хроничните нелесни заразени рани представляват проблем както за лекарите, така и за пациентите. Въпреки че много превръзки твърдят, че антимикробната ефективност, изследванията рядко се фокусират върху други ключови фактори, влияещи върху микросредата на раната. Това проучване показва, че различните сребърни технологии имат различна антимикробна ефикасност и важното - различни ефекти върху околната среда на раната и заздравяването, независимо от инфекцията. Въпреки че тези изследвания in vitro и in vivo показват ефективността на тези превръзки при лечение на инфекции с рани и насърчаване на изцеление, са необходими рандомизирани контролирани изпитвания, за да се оцени ефективността на тези превръзки в клиниката.
Използваните и/или анализирани набори от данни по време на текущото проучване са достъпни от съответния автор по разумна заявка.
Време за публикация: юли-15-2024