Хетерогенност на човешките скелетни мускулни влакна отвъд тежката верига на миозина

Благодарим ви, че посетихте nature.com. Версията на браузъра, която използвате, има ограничена CSS поддръжка. За най-добро изживяване препоръчваме да използвате най-новата версия на браузъра (или да деактивирате режима на съвместимост в Internet Explorer). Освен това, за да се гарантира непрекъсната поддръжка, този сайт ще бъде без стилове и JavaScript.
Скелетният мускул е хетерогенна тъкан, съставена предимно от миофибрили, които при хората обикновено се класифицират в три типа: един „бавен“ (тип 1) и два „бързи“ (типове 2А и 2X). Хетерогенността между и в рамките на традиционните типове миофибрили обаче остава слабо проучена. Приложихме транскриптомни и протеомни подходи съответно към 1050 и 1038 отделни миофибрили от човешки vastus lateralis. Протеомното проучване включва мъже, а транскриптомното проучване - 10 мъже и 2 жени. В допълнение към изоформите на тежките вериги на миозина, идентифицирахме метаболитни протеини, рибозомни протеини и клетъчни свързващи протеини като източници на многоизмерна вариабилност на интермиофибрилите. Освен това, въпреки идентифицирането на клъстери от бавни и бързи влакна, нашите данни показват, че влакната тип 2X са фенотипно неразличими от другите бързосъкращаващи се влакна. Освен това, класификацията, базирана на тежките вериги на миозина, е недостатъчна, за да опише фенотипа на миофибрилите при немалинови миопатии. Като цяло, нашите данни показват многомерна хетерогенност на миофибрите, като източниците на вариации се простират отвъд изоформите на тежката верига на миозина.
Клетъчната хетерогенност е присъща характеристика на всички биологични системи, позволявайки на клетките да се специализират, за да отговорят на различните нужди на тъканите и клетките.1 Традиционният възглед за хетерогенността на скелетните мускулни влакна е, че моторните неврони определят типа влакно в рамките на моторната единица и че типът влакно (т.е. тип 1, тип 2A и тип 2X при хората) се определя от характеристиките на изоформите на тежката верига на миозина (MYH).2 Първоначално това се е основавало на тяхната pH АТФазна нестабилност,3,4 а по-късно на тяхната молекулярна експресия на MYH.5 Въпреки това, с идентифицирането и последващото приемане на „смесени“ влакна, които коекспресират множество MYH в различни пропорции, скелетните мускулни влакна все повече се разглеждат като континуум, а не като отделни типове влакна.6 Въпреки това, областта все още разчита до голяма степен на MYH като основен класификатор за класификация на миофибри, възглед, вероятно повлиян от ограниченията и значителните отклонения на ранните изследвания върху гризачи, чиито профили на експресия на MYH и диапазон от типове влакна се различават от тези при хората.2 Ситуацията се усложнява допълнително от факта, че различните човешки скелетни мускули показват разнообразен диапазон от типове влакна.7 Огромният мускул lateralis е смесен мускул с междинен (и следователно представителен) профил на експресия на MYH.7 Освен това, леснотата на вземане на проби го прави най-добре изученият мускул при хората.
Следователно, безпристрастното изследване на разнообразието на скелетните мускулни влакна с помощта на мощни „омически“ инструменти е критично, но и предизвикателно, отчасти поради многоядрената природа на скелетните мускулни влакна. Технологиите за транскриптомика8,9 и протеомика10 обаче претърпяха революция в чувствителността си през последните години благодарение на различни технологични постижения, позволявайки анализ на скелетните мускули с резолюция на ниво едно влакно. В резултат на това е постигнат значителен напредък в характеризирането на разнообразието на едно влакно и техния отговор на атрофични стимули и стареене11,12,13,14,15,16,17,18. Важно е, че тези технологични постижения имат клинични приложения, позволявайки по-подробно и прецизно характеризиране на свързаната със заболяването дисрегулация. Например, патофизиологията на немалиновата миопатия, едно от най-често срещаните наследствени мускулни заболявания (MIM 605355 и MIM 161800), е сложна и объркваща.19,20 Следователно, по-добрата характеристика на дисрегулацията на скелетните мускулни влакна би могла да доведе до значителен напредък в разбирането ни за това заболяване.
Разработихме методи за транскриптомен и протеомен анализ на единични скелетни мускулни влакна, ръчно изолирани от човешки биопсични проби, и ги приложихме към хиляди влакна, което ни позволи да изследваме клетъчната хетерогенност на човешките скелетни мускулни влакна. В хода на тази работа демонстрирахме силата на транскриптомното и протеомно фенотипизиране на мускулните влакна и идентифицирахме метаболитни, рибозомни и клетъчни свързващи протеини като значими източници на междувлакнеста вариабилност. Освен това, използвайки този протеомен работен процес, характеризирахме клиничното значение на нематодната миопатия в единични скелетни мускулни влакна, разкривайки координирано изместване към неокислителни влакна, независимо от типа влакно, базирано на MYH (миопатия на човешката анатомия).
За да изследваме хетерогенността на човешките скелетни мускулни влакна, разработихме два работни процеса, които да позволят анализ на транскриптоми и протеоми на единични скелетни мускулни влакна (Фигура 1А и Допълнителна Фигура 1А). Разработихме и оптимизирахме няколко методологични стъпки, от съхранение на проби и запазване на целостта на РНК и протеини до оптимизиране на производителността за всеки подход. За анализ на транскриптоми това беше постигнато чрез вмъкване на специфични за пробата молекулярни баркодове в началната стъпка на обратната транскрипция, което позволи обединяването на 96 влакна за ефективна последваща обработка. По-дълбокото секвениране (±1 милион прочитания на влакно) в сравнение с традиционните подходи за единични клетки допълнително обогати транскриптомните данни.21 За протеомика използвахме кратък хроматографски градиент (21 минути), комбиниран с DIA-PASEF събиране на данни на timsTOF масспектрометър, за да оптимизираме дълбочината на протеома, като същевременно поддържаме висока производителност. 22,23 За да изследваме хетерогенността на здравите скелетни мускулни влакна, характеризирахме транскриптомите на 1050 отделни влакна от 14 здрави възрастни донори и протеомите на 1038 влакна от 5 здрави възрастни донори (Допълнителна таблица 1). В тази статия тези набори от данни са наречени съответно 1000-влакнести транскриптоми и протеоми. Нашият подход откри общо 27 237 транскрипта и 2983 протеина в транскриптомния и протеомния анализ на 1000 влакна (Фигура 1А, Допълнителни набори от данни 1–2). След филтриране на транскриптомните и протеомните набори от данни за >1000 открити гена и 50% валидни стойности на влакно, бяха извършени последващи биоинформатични анализи съответно за 925 и 974 влакна в транскриптома и протеома. След филтриране, средно 4257 ± 1557 гена и 2015 ± 234 протеина (средно ± SD) бяха открити на влакно, с ограничена междуиндивидуална вариабилност (Допълнителни фигури 1B–C, Допълнителни набори от данни 3–4). Въпреки това, вътрешноиндивидуалната вариабилност беше по-изразена между участниците, вероятно поради разликите в добива на РНК/протеин между влакна с различна дължина и площ на напречното сечение. За повечето протеини (>2000) коефициентът на вариация беше под 20% (Допълнителна фигура 1D). И двата метода позволиха улавяне на широк динамичен диапазон от транскрипти и протеини със силно експресирани сигнатури, важни за мускулната контракция (напр. ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (Допълнителни фигури 1E–F). Повечето от идентифицираните характеристики бяха общи между транскриптомните и протеомните набори от данни (Допълнителна фигура 1G), а средните интензитети на UMI/LFQ на тези характеристики бяха сравнително добре корелирани (r = 0,52) (Допълнителна фигура 1H).
Работен процес за транскриптомика и протеомика (създаден с BioRender.com). BD Криви на динамичния диапазон за MYH7, MYH2 и MYH1 и изчислени прагове за определяне на типа влакна. E, F Разпределение на експресията на MYH между влакната в набори от транскриптомика и протеомика. G, H Графики на равномерно апроксимиране и проекция на разнообразието (UMAP) за транскриптомика и протеомика, оцветени по типа влакна, базирани на MYH. I, J Характеристични графики, показващи експресията на MYH7, MYH2 и MYH1 в набори от транскриптомика и протеомика.
Първоначално си поставихме за цел да присвоим тип влакна, базиран на MYH, на всяко влакно, използвайки оптимизиран подход, който се възползва от високата чувствителност и динамичния диапазон на експресията на MYH в omics наборите от данни. Предишни проучвания са използвали произволни прагове за етикетиране на влакната като чисти тип 1, тип 2A, тип 2X или смесени, въз основа на фиксиран процент експресия на различни MYH11,14,24. Използвахме различен подход, при който експресията на всяко влакно беше класирана по MYH, които използвахме за типизиране на влакната: MYH7, MYH2 и MYH1, съответстващи съответно на влакна тип 1, тип 2A и тип 2X. След това математически изчислихме долната точка на инфлексия на всяка получена крива и я използвахме като праг, за да определим влакната като положителни (над прага) или отрицателни (под прага) за всеки MYH (Фигура 1B–D). Тези данни показват, че MYH7 (Фигура 1B) и MYH2 (Фигура 1C) имат по-отчетливи профили на експресия on/off на ниво РНК в сравнение с ниво протеин. Всъщност, на протеиново ниво, много малко влакна не експресираха MYH7 и никое влакно не имаше 100% MYH2 експресия. След това използвахме предварително определени прагове на експресия, за да присвоим MYH-базирани типове влакна на всички влакна във всеки набор от данни. Например, MYH7+/MYH2-/MYH1- влакната бяха присвоени на тип 1, докато MYH7-/MYH2+/MYH1+ влакната бяха присвоени на смесен тип 2A/2X (вижте Допълнителна таблица 2 за пълно описание). Обединявайки всички влакна, наблюдавахме забележително сходно разпределение на MYH-базираните типове влакна както на РНК (Фигура 1E), така и на протеиново (Фигура 1F) ниво, докато относителният състав на MYH-базираните типове влакна варираше при различните индивиди, както се очакваше (Допълнителна фигура 2A). Повечето влакна бяха класифицирани или като чист тип 1 (34–35%), или като тип 2A (36–38%), въпреки че бяха открити и значителен брой смесени тип 2A/2X влакна (16–19%). Поразителна разлика е, че чистите влакна тип 2X могат да бъдат открити само на ниво РНК, но не и на ниво протеин, което предполага, че бързата експресия на MYH е поне частично регулирана посттранскрипционно.
Валидирахме нашия метод за типизиране на MYH влакна, базиран на протеомика, използвайки точково блотиране на базата на антитела, и двата метода постигнаха 100% съгласие при идентифицирането на чисти влакна тип 1 и тип 2A (вижте Допълнителна фигура 2B). Подходът, базиран на протеомика, обаче беше по-чувствителен, по-ефективен при идентифициране на смесени влакна и количествено определяне на дела на всеки MYH ген във всяко влакно. Тези данни демонстрират ефективността на използването на обективен, високочувствителен, базиран на омикс подход за характеризиране на типовете скелетни мускулни влакна.
След това използвахме комбинираната информация, предоставена от транскриптомиката и протеомиката, за да класифицираме обективно миофибрите въз основа на техния пълен транскриптом или протеом. Използвайки метода на равномерно многообразно приближение и проекция (UMAP), за да намалим размерността до шест главни компонента (Допълнителни фигури 3A–B), успяхме да визуализираме вариабилността на миофибрите в транскриптома (Фигура 1G) и протеома (Фигура 1H). Забележително е, че миофибрите не бяха групирани по участници (Допълнителни фигури 3C–D) или дни на тестване (Допълнителна фигура 3E) нито в транскриптомичните, нито в протеомните набори от данни, което предполага, че вътрешно-субектната вариабилност в скелетните мускулни влакна е по-висока от междусубектната вариабилност. В UMAP графиката се появиха два отделни клъстера, представляващи „бързи“ и „бавни“ миофибри (Фигури 1G–H). MYH7+ (бавни) миофибри бяха групирани в положителния полюс на UMAP1, докато MYH2+ и MYH1+ (бързи) миофибри бяха групирани в отрицателния полюс на UMAP1 (Фигури 1I–J). Въпреки това, не е направено разграничение между типовете бързосъкращаващи се влакна (т.е. тип 2A, тип 2X или смесени 2A/2X) въз основа на експресията на MYH, което предполага, че експресията на MYH1 (Фигура 1I–J) или други класически маркери на 2X миофибри, като ACTN3 или MYLK2 (Допълнителни фигури 4A–B), не прави разлика между различните типове миофибри, когато се разглежда целият транскриптом или протеом. Освен това, в сравнение с MYH2 и MYH7, малко транскрипти или протеини бяха положително корелирани с MYH1 (Допълнителни фигури 4C–H), което предполага, че изобилието на MYH1 не отразява напълно транскриптома/протеома на миофибрите. Подобни заключения бяха направени при оценката на смесената експресия на трите MYH изоформи на ниво UMAP (Допълнителни фигури 4I–J). По този начин, докато 2X влакната могат да бъдат идентифицирани на ниво транскрипт само въз основа на количествено определяне на MYH, MYH1+ влакната не се различават от други бързи влакна, когато се разглежда целият транскриптом или протеом.
Като първоначално изследване на хетерогенността на бавните влакна отвъд MYH, ние оценихме четири установени протеина, специфични за типа бавни влакна: TPM3, TNNT1, MYL3 и ATP2A22. Подтиповете бавни влакна показаха високи, макар и не перфектни, корелации на Пиърсън с MYH7 както в транскриптомиката (допълнителна фигура 5А), така и в протеомиката (допълнителна фигура 5B). Приблизително 25% и 33% от бавните влакна не бяха класифицирани като чисти бавни влакна от всички генни/протеинови подтипове съответно в транскриптомиката (допълнителна фигура 5C) и протеомиката (допълнителна фигура 5D). Следователно, класификацията на бавните влакна, базирана на множество генни/протеинови подтипове, въвежда допълнителна сложност, дори за протеини, за които е известно, че са специфични за типа влакна. Това предполага, че класификацията на влакната, базирана на изоформи на едно генно/протеиново семейство, може да не отразява адекватно истинската хетерогенност на скелетните мускулни влакна.
За да изследваме по-нататък фенотипната вариабилност на човешките скелетни мускулни влакна в мащаба на целия омичен модел, извършихме безпристрастно намаляване на размерността на данните, използвайки анализ на главните компоненти (PCA) (Фигура 2A). Подобно на UMAP графиките, нито участникът, нито денят на тестване са повлияли на клъстерирането на влакната на ниво PCA (Допълнителни фигури 6A–C). И в двата набора от данни, типът влакна, базиран на MYH, беше обяснен с PC2, който показа клъстер от бавно съкращаващи се влакна тип 1 и втори клъстер, съдържащ бързо съкращаващи се влакна тип 2A, тип 2X и смесени 2A/2X влакна (Фигура 2A). И в двата набора от данни тези два клъстера бяха свързани чрез малък брой смесени влакна тип 1/2A. Както се очакваше, анализът на свръхпредставянето на основните PC драйвери потвърди, че PC2 се задвижва от контрактилни и метаболитни сигнатури (Фигура 2B и Допълнителни фигури 6D–E, Допълнителни набори от данни 5–6). Като цяло, типът влакна, базиран на MYH, се оказва достатъчен, за да обясни непрекъснатите вариации по протежение на PC2, с изключение на така наречените 2X влакна, които са разпределени в целия транскриптом в рамките на бързия клъстер.
A. Графики от анализа на главните компоненти (PCA) на набори от данни от транскриптоми и протеоми, оцветени според типа влакно, базирани на MYH. B. Анализ на обогатяване на транскриптни и протеинови драйвери в PC2 и PC1. Статистическият анализ е извършен с помощта на пакета clusterProfiler и p-стойности, коригирани по Benjamini-Hochberg. C, D. PCA графики, оцветени според термините на междуклетъчната адхезионна генна онтология (GO) в транскриптома и костамерните GO термини в протеома. Стрелките представляват транскриптните и протеиновите драйвери и техните посоки. E, F. Графики от апроксимация и проекция на равномерно многообразие (UMAP) на клинично значими характеристики, показващи градиенти на експресия, независимо от типа бавно/бързо влакно. G, H. Корелации между PC2 и PC1 драйвери в транскриптоми и протеоми.
Неочаквано, типът миофибри, базиран на MYH, обяснява само втората най-висока степен на вариабилност (PC2), което предполага, че други биологични фактори, несвързани с типа миофибри, базиран на MYH (PC1), играят важна роля в регулирането на хетерогенността на скелетните мускулни влакна. Анализът на свръхпредставянето на най-важните фактори в PC1 разкри, че вариабилността в PC1 се определя предимно от клетъчно-клетъчната адхезия и съдържанието на рибозоми в транскриптома, както и от костамерите и рибозомните протеини в протеома (Фигура 2B и Допълнителни фигури 6D–E, Допълнителен набор от данни 7). В скелетните мускули костамерите свързват Z-диска със сарколемата и участват в предаването на сила и сигнализирането. 25 Анотирани PCA графики, използващи характеристики на клетъчно-клетъчната адхезия (транскриптом, Фигура 2C) и костамер (протеом, Фигура 2D), разкриват силно изместване наляво в PC1, което показва, че тези характеристики са обогатени с определени влакна.
По-детайлно изследване на клъстерирането на миофибри на ниво UMAP разкри, че повечето характеристики показват независим от типа на миофибрите MYH-базиран градиент на експресия, а не специфичен за подклъстера на миофибрите. Тази непрекъснатост е наблюдавана за няколко гена, свързани с патологични състояния (Фигура 2E), като CHCHD10 (невромускулно заболяване), SLIT3 (мускулна атрофия), CTDNEP1 (мускулно заболяване). Тази непрекъснатост е наблюдавана и в целия протеом, включително протеини, свързани с неврологични разстройства (UGDH), инсулинова сигнализация (PHIP) и транскрипция (HIST1H2AB) (Фигура 2F). Взети заедно, тези данни показват непрекъснатост в независимата от типа на влакната хетерогенност на бавно/бързо потрепване в различните миофибри.
Интересно е, че драйверните гени в PC2 показват добра транскриптомно-протеомна корелация (r = 0.663) (Фигура 2G), което предполага, че бавно- и бързосъкращаващите се типове влакна, и по-специално контрактилните и метаболитни свойства на скелетните мускулни влакна, са транскрипционно регулирани. Драйверните гени в PC1 обаче не показват транскриптомно-протеомна корелация (r = -0.027) (Фигура 2H), което предполага, че вариациите, несвързани с бавно/бързосъкращаващите се типове влакна, се регулират до голяма степен посттранскрипционно. Тъй като вариациите в PC1 се обясняват предимно с термини на онтологията на рибозомните гени и като се има предвид, че рибозомите играят ключова и специализирана роля в клетката, като активно участват и влияят върху транслацията на протеини,31 ние се заехме да изследваме тази неочаквана рибозомна хетерогенност.
Първо оцветихме графиката на протеомния анализ на главните компоненти според относителното изобилие на протеини в GOCC термина „цитоплазмена рибозома“ (Фигура 3А). Въпреки че този термин е обогатен от положителната страна на PC1, което води до малък градиент, рибозомните протеини задвижват разделянето и в двете посоки на PC1 (Фигура 3А). Рибозомните протеини, обогатени от отрицателната страна на PC1, включват RPL18, RPS18 и RPS13 (Фигура 3B), докато RPL31, RPL35 и RPL38 (Фигура 3C) бяха основните двигатели от положителната страна на PC1. Интересното е, че RPL38 и RPS13 бяха силно експресирани в скелетните мускули в сравнение с други тъкани (Допълнителна фигура 7А). Тези отличителни рибозомни сигнатури в PC1 не бяха наблюдавани в транскриптома (Допълнителна фигура 7B), което показва посттранскрипционна регулация.
A. Графика на анализа на главните компоненти (PCA), оцветена според термините на цитоплазмената рибозомна генна онтология (GO) в протеома. Стрелките показват посоката на протеин-медиираната вариация в PCA графиката. Дължината на линията съответства на резултата от главните компоненти за даден протеин. B, C. PCA графики на характеристиките за RPS13 и RPL38. D. Неконтролиран йерархичен клъстерен анализ на цитоплазмени рибозомни протеини. E. Структурен модел на 80S рибозомата (PDB: 4V6X), подчертаващ рибозомни протеини с различно съдържание в скелетните мускулни влакна. F. Рибозомни протеини с различна стехиометрия, локализирани близо до изходния канал на mRNA.
Концепциите за рибозомна хетерогенност и специализация са били предложени по-рано, при които наличието на различни рибозомни субпопулации (рибозомна хетерогенност) може директно да повлияе на транслацията на протеини в различни тъкани32 и клетки33 чрез селективна транслация на специфични пулове от mRNA транскрипти34 (рибозомна специализация). За да идентифицираме субпопулации от рибозомни протеини, коекспресирани във влакната на скелетните мускули, извършихме неконтролиран йерархичен клъстерен анализ на рибозомни протеини в протеома (Фигура 3D, Допълнителен набор от данни 8). Както се очакваше, рибозомните протеини не се клъстерираха по тип влакно въз основа на MYH. Въпреки това, идентифицирахме три различни клъстера от рибозомни протеини; първият клъстер (ribosomal_cluster_1) е корегулиран с RPL38 и следователно има повишена експресия във влакна с положителен PC1 профил. Вторият клъстер (ribosomal_cluster_2) е корегулиран с RPS13 и е повишен във влакна с отрицателен PC1 профил. Третият клъстер (ribosomal_cluster_3) не показва координирана диференциална експресия във влакната на скелетните мускули и може да се счита за „ядрото“ на рибозомния протеин на скелетните мускули. И двата рибозомни клъстера 1 и 2 съдържат рибозомни протеини, за които преди това е доказано, че регулират алтернативната транслация (напр. RPL10A, RPL38, RPS19 и RPS25) и функционално влияят върху развитието (напр. RPL10A, RPL38).34,35,36,37,38 В съответствие с резултатите от PCA, наблюдаваното хетерогенно представяне на тези рибозомни протеини във влакната също показва непрекъснатост (Допълнителна фигура 7C).
За да визуализираме местоположението на хетерогенните рибозомни протеини в рибозомата, използвахме структурен модел на човешката 80S рибозома (Protein Data Bank: 4V6X) (Фигура 3E). След изолиране на рибозомни протеини, принадлежащи към различни рибозомни клъстери, техните местоположения не бяха тясно подравнени, което предполага, че нашият подход не успя да осигури обогатяване за определени региони/фракции на рибозомата. Интересното е обаче, че делът на протеините с големи субединици в клъстер 2 беше по-нисък, отколкото в клъстери 1 и 3 (Допълнителна фигура 7D). Наблюдавахме, че протеините с променена стехиометрия в скелетните мускулни влакна са локализирани предимно на повърхността на рибозомата (Фигура 3E), което е в съответствие с тяхната способност да взаимодействат с елементите на вътрешното място за влизане на рибозомата (IRES) в различни популации на мРНК, като по този начин координират селективната транслация. 40, 41 Освен това, много протеини с променена стехиометрия в скелетните мускулни влакна са разположени близо до функционални региони, като например изходния тунел на мРНК (Фигура 3F), които селективно регулират транслационното удължаване и ареста на специфични пептиди. 42 В обобщение, нашите данни показват, че стехиометрията на рибозомните протеини на скелетните мускули показва хетерогенност, което води до разлики между скелетните мускулни влакна.
Следващата ни цел беше да идентифицираме сигнатурите на бързо и бавно съкращаващите се влакна и да изследваме механизмите на тяхната транскрипционна регулация. Сравнявайки клъстерите от бързо и бавно съкращаващи се влакна, дефинирани от UMAP в двата набора от данни (Фигури 1G–H и 4A–B), транскриптомните и протеомните анализи идентифицираха съответно 1366 и 804 различно изобилстващи характеристики (Фигури 4A–B, Допълнителни набори от данни 9–12). Наблюдавахме очакваните разлики в сигнатурите, свързани със саркомерите (напр. тропомиозин и тропонин), свързването на възбуждане-контракция (SERCA изоформи) и енергийния метаболизъм (напр. ALDOA и CKB). Освен това, транскриптите и протеините, регулиращи убиквитинирането на протеините, бяха диференциално експресирани в бързо и бавно съкращаващи се влакна (напр. USP54, SH3RF2, USP28 и USP48) (Фигури 4A–B). Освен това, генът на микробния протеин RP11-451G4.2 (DWORF), за който преди това е доказано, че се експресира диференциално в различните типове мускулни влакна на агнешко43 и усилва SERCA активността в сърдечния мускул44, е значително повишен в бавните скелетни мускулни влакна (Фигура 4А). По подобен начин, на ниво отделни влакна, са наблюдавани значителни разлики в известни сигнатури, като например свързани с метаболизма изоформи на лактатдехидрогеназа (LDHA и LDHB, Фигура 4C и Допълнителна Фигура 8A)45,46, както и неизвестни досега специфични за типа влакна сигнатури (като IRX3, USP54, USP28 и DPYSL3) (Фигура 4C). Наблюдавано е значително припокриване на диференциално експресирани характеристики между транскриптомните и протеомните набори от данни (Допълнителна Фигура 8B), както и корелация на промяната в пъти, обусловена главно от по-изразената диференциална експресия на саркомерните характеристики (Допълнителна Фигура 8C). Трябва да се отбележи, че някои сигнатури (напр. USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) показват силна пост-транскрипционна регулация само на протеомно ниво и имат специфични за типа влакна профили на експресия с бавно/бързо потрепване (допълнителна фигура 8C).
A и B вулканични диаграми, сравняващи бавни и бързи клъстери, идентифицирани чрез диаграмите на равномерното многообразие, апроксимация и проекция (UMAP) на фигури 1G–H. Цветните точки представляват транскрипти или протеини, които са значително различни при FDR < 0,05, а по-тъмните точки представляват транскрипти или протеини, които са значително различни при log change > 1. Двупосочен статистически анализ е извършен с помощта на теста на Wald DESeq2 с коригирани по Benjamini-Hochberg p-стойности (транскриптомика) или метода на линейния модел на Limma с емпиричен байесов анализ, последван от корекция по Benjamini-Hochberg за множествени сравнения (протеомика). C Сигнатурни диаграми на избрани диференциално експресирани гени или протеини между бавни и бързи влакна. D Анализ на обогатяване на значително диференциално експресирани транскрипти и протеини. Припокриващите се стойности са обогатени и в двата набора от данни, стойностите на транскриптомите са обогатени само в транскриптома, а стойностите на протеомите са обогатени само в протеома. Статистическият анализ е извършен с помощта на пакета clusterProfiler с коригирани по Benjamini-Hochberg p-стойности. E. Специфични за типа влакна транскрипционни фактори, идентифицирани от SCENIC въз основа на получените от SCENIC резултати за специфичност на регулаторите и диференциална експресия на мРНК между типовете влакна. F. Профилиране на избрани транскрипционни фактори, диференциално експресирани между бавни и бързи влакна.
След това извършихме анализ на свръхпредставеност на диференциално представени гени и протеини (Фигура 4D, Допълнителен набор от данни 13). Обогатяването на пътищата за характеристики, които се различават между двата набора от данни, разкри очаквани разлики, като например процесите на β-окисление на мастни киселини и метаболизъм на кетони (бавни влакна), контракцията на миофиламенти/мускулни мускули (съответно бързи и бавни влакна) и катаболните процеси на въглехидрати (бързи влакна). Активността на серин/треонин протеин фосфатазата също беше повишена в бързите влакна, обусловена от характеристики като регулаторните и каталитичните фосфатазни субединици (PPP3CB, PPP1R3D и PPP1R3A), за които е известно, че регулират метаболизма на гликогена (47) (Допълнителни фигури 8D–E). Други пътища, обогатени с бързи влакна, включват процесиращи (P-) телца (YTHDF3, TRIM21, LSM2) в протеома (допълнителна фигура 8F), потенциално участващи в пост-транскрипционната регулация (48), и активност на транскрипционните фактори (SREBF1, RXRG, RORA) в транскриптома (допълнителна фигура 8G). Бавните влакна са обогатени с оксидоредуктазна активност (BDH1, DCXR, TXN2) (допълнителна фигура 8H), свързване с амиди (CPTP, PFDN2, CRYAB) (допълнителна фигура 8I), извънклетъчна матрица (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (допълнителна фигура 8J) и рецептор-лигандна активност (FNDC5, SPX, NENF) (допълнителна фигура 8K).
За да получим по-задълбочена представа за транскрипционната регулация, която е в основата на характеристиките на типа бавни/бързи мускулни влакна, извършихме анализ на обогатяване на транскрипционни фактори, използвайки SCENIC49 (Допълнителен набор от данни 14). Много транскрипционни фактори бяха значително обогатени между бързите и бавните мускулни влакна (Фигура 4E). Това включваше транскрипционни фактори като MAFA, който преди това беше свързан с развитието на бързи мускулни влакна,50 както и няколко транскрипционни фактора, които преди това не бяха свързани със специфични за типа мускулни влакна генни програми. Сред тях PITX1, EGR1 и MYF6 бяха най-обогатените транскрипционни фактори в бързите мускулни влакна (Фигура 4E). За разлика от тях, ZSCAN30 и EPAS1 (известен също като HIF2A) бяха най-обогатените транскрипционни фактори в бавните мускулни влакна (Фигура 4E). В съответствие с това, MAFA се експресира на по-високи нива в UMAP региона, съответстващ на бързите мускулни влакна, докато EPAS1 имаше обратния модел на експресия (Фигура 4F).
В допълнение към известните гени, кодиращи протеини, съществуват множество некодиращи РНК биотипове, които могат да участват в регулацията на човешкото развитие и заболявания.51, 52 В транскриптомни набори от данни, няколко некодиращи РНК проявяват специфичност за типа влакна (Фигура 5А и Допълнителен набор от данни 15), включително LINC01405, който е силно специфичен за бавните влакна и се съобщава, че е намален в мускулите от пациенти с митохондриална миопатия.53 За разлика от това, RP11-255P5.3, съответстващ на гена lnc-ERCC5-5 (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2)54, показва специфичност за типа бързи влакна. Както LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h), така и RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) показват специфичност за скелетните мускули (допълнителни фигури 9A–B) и нямат известни контрактилни гени в геномната си среда от 1 Mb, което предполага, че те играят специализирана роля в регулирането на типовете влакна, а не в регулирането на съседни контрактилни гени. Специфичните за типа влакна експресионни профили на LINC01405 и RP11-255P5.3, съответно, са потвърдени с помощта на RNAscope (фигури 5B–C).
A. Некодиращите РНК транскрипти са значително регулирани в бавно- и бързосъкращаващите се мускулни влакна. B. Представителни RNAscope изображения, показващи специфичността на типа бавно- и бързосъкращаващи се влакна съответно на LINC01405 и RP11-255P5.3. Скала = 50 μm. C. Количествено определяне на експресията на некодираща РНК, специфична за типа миофибри, определена чрез RNAscope (n = 3 биопсии от независими индивиди, сравняващи бързи и бавни мускулни влакна във всеки индивид). Статистическият анализ е извършен с помощта на двустранен t-тест на Стюдънт. Кутиевидните диаграми показват медианата и първия и третия квартил, като нишките сочат към минималните и максималните стойности. D. De novo работен процес за идентифициране на микробни протеини (създаден с BioRender.com). E. Микробният протеин LINC01405_ORF408:17441:17358 е специфично експресиран в бавни скелетни мускулни влакна (n = 5 биопсии от независими участници, сравняващи бързи и бавни мускулни влакна във всеки участник). Статистическият анализ е извършен с помощта на метода на линейния модел на Лим, комбиниран с емпиричен байесов подход, последван от метода на Бенджамини-Хохберг за множествени сравнения с корекция на p-стойността. Диаграмите в кутии показват медианата, първия и третия квартил, като нишките сочат към максималните/минималните стойности.
Наскоро проучвания показват, че много предполагаеми некодиращи транскрипти кодират транскрибирани микробни протеини, някои от които регулират мускулната функция.44, 55 За да идентифицираме микробни протеини с потенциална специфичност за типа влакна, ние претърсихме нашия набор от данни с 1000 влакнести протеома, използвайки персонализиран FASTA файл, съдържащ последователностите на некодиращи транскрипти (n = 305), открити в набора от данни с 1000 влакнести транскриптома (Фигура 5D). Идентифицирахме 197 микробни протеина от 22 различни транскрипта, 71 от които бяха диференциално регулирани между бавни и бързи скелетни мускулни влакна (Допълнителна фигура 9C и Допълнителен набор от данни 16). За LINC01405 бяха идентифицирани три микробни протеинови продукта, единият от които показа подобна специфичност за бавните влакна на своя транскрипт (Фигура 5E и Допълнителна фигура 9D). По този начин идентифицирахме LINC01405 като ген, кодиращ микробен протеин, специфичен за бавни скелетни мускулни влакна.
Разработихме цялостен работен процес за широкомащабна протеомна характеристика на отделни мускулни влакна и идентифицирахме регулатори на хетерогенността на влакната в здрави състояния. Приложихме този работен процес, за да разберем как немалиновите миопатии влияят върху хетерогенността на скелетните мускулни влакна. Немалиновите миопатии са наследствени мускулни заболявания, които причиняват мускулна слабост и при засегнатите деца се проявяват с редица усложнения, включително респираторен дистрес, сколиоза и ограничена подвижност на крайниците.19,20 Обикновено при немалиновите миопатии патогенните варианти в гени като актин алфа 1 (ACTA1) водят до преобладаване на състава на бавно съкращаващите се миофибри, въпреки че този ефект е хетерогенен. Едно забележително изключение е тропонин Т1 немалинова миопатия (TNNT1), която има преобладаване на бързи влакна. По този начин, по-доброто разбиране на хетерогенността, която е в основата на наблюдаваната при немалиновите миопатии дисрегулация на скелетните мускулни влакна, може да помогне за разкриване на сложната връзка между тези заболявания и типа миофибри.
В сравнение със здрави контроли (n=3 на група), миофибри, изолирани от пациенти с немалинова миопатия с мутации в гените ACTA1 и TNNT1, показват изразена атрофия или дистрофия на миофибрите (Фигура 6А, Допълнителна таблица 3). Това представлява значителни технически предизвикателства за протеомния анализ поради ограниченото количество наличен материал. Въпреки това успяхме да открием 2485 протеина в 272 скелетни миофибри. След филтриране за поне 1000 количествено определени протеина на влакно, 250 влакна бяха подложени на последващ биоинформатичен анализ. След филтриране бяха количествено определени средно 1573 ± 359 протеина на влакно (Допълнителна фигура 10А, Допълнителни набори от данни 17–18). Забележително е, че въпреки значителното намаляване на размера на влакната, дълбочината на протеома на пробите от пациенти с немалинова миопатия е само умерено намалена. Освен това, обработката на тези данни с помощта на наши собствени FASTA файлове (включително некодиращи транскрипти) ни позволи да идентифицираме пет микробни протеина в скелетните миофибри от пациенти с немалинова миопатия (Допълнителен набор от данни 19). Динамичният диапазон на протеома беше значително по-широк, а общите протеини в контролната група корелираха добре с резултатите от предишен анализ на протеома с 1000 влакна (Допълнителна фигура 10B-C).
A. Микроскопски изображения, показващи атрофия или дистрофия на влакната и преобладаване на различни типове влакна въз основа на MYH при ACTA1 и TNNT1 немалинови миопатии (NM). Мащабна лента = 100 μm. За да се осигури възпроизводимост на оцветяването при пациенти с ACTA1 и TNNT1, три биопсии от пациенти бяха оцветени два до три пъти (четири среза на случай), преди да се изберат представителни изображения. B. Пропорции на типовете влакна при участниците въз основа на MYH. C. Графика на анализа на главните компоненти (PCA) на скелетните мускулни влакна при пациенти с немалинови миопатии и контролна група. D. Скелетни мускулни влакна от пациенти с немалинови миопатии и контролна група, проектирани върху PCA графика, определена от 1000-те анализирани влакна на Фигура 2. Например, вулканични графики, сравняващи разликите между участници с ACTA1 и TNNT1 немалинови миопатии и контролна група, и между участници с ACTA1 и TNNT1 немалинови миопатии. Цветните кръгове означават протеини, които са били значително различни при π < 0,05, а тъмните точки означават протеини, които са били значително различни при FDR < 0,05. Статистическият анализ е извършен с помощта на метода на линейния модел на Limma и емпиричните байесови методи, последвано от корекция на p-стойността за множествени сравнения, използвайки метода на Benjamini-Hochberg. H. Анализ на обогатяване на значително диференциално експресирани протеини в целия протеом и във влакна тип 1 и 2A. Статистическият анализ е извършен с помощта на пакета clusterProfiler и коригирани по Benjamini-Hochberg p-стойности. I, J. Графики на анализа на главните компоненти (PCA), оцветени от термини на извънклетъчния матрикс и митохондриалната генна онтология (GO).
Тъй като немалиновите миопатии могат да повлияят на дела на MYH-експресиращите типове миофибри в скелетните мускули,19,20 първо изследвахме MYH-експресиращите типове миофибри при пациенти с немалинови миопатии и контролна група. Определихме типа миофибри, използвайки безпристрастен метод, описан по-рано за анализа с 1000 миофибри (Допълнителни фигури 10D–E) и отново не успяхме да идентифицираме чисти 2X миофибри (Фигура 6B). Наблюдавахме хетерогенен ефект на немалиновите миопатии върху типа миофибри, тъй като двама пациенти с ACTA1 мутации имаха повишен дял на тип 1 миофибри, докато двама пациенти с TNNT1 немалинова миопатия имаха намален дял на тип 1 миофибри (Фигура 6B). В действителност, експресията на MYH2 и бързите тропонинов изоформи (TNNC2, TNNI2 и TNNT3) е намалена при ACTA1-немалинови миопатии, докато експресията на MYH7 е намалена при TNNT1-немалинови миопатии (Допълнителна фигура 11А). Това е в съответствие с предишни съобщения за хетерогенно превключване на типа миофибри при немалинови миопатии.19,20 Потвърдихме тези резултати чрез имунохистохимия и установихме, че пациентите с ACTA1-немалинова миопатия имат преобладаване на миофибри тип 1, докато пациентите с TNNT1-немалинова миопатия имат обратния модел (Фигура 6А).
На ниво протеом с единични влакна, скелетните мускулни влакна от пациенти с ACTA1 и TNNT1 немалинова миопатия се групират с по-голямата част от контролните влакна, като влакната на TNNT1 немалинова миопатия обикновено са най-силно засегнати (Фигура 6C). Това е особено очевидно при нанасяне на графики на анализа на главните компоненти (PCA) на псевдонадути влакна за всеки пациент, като пациенти 2 и 3 с TNNT1 немалинова миопатия изглеждат най-отдалечени от контролните проби (Допълнителна фигура 11B, Допълнителен набор от данни 20). За да разберем по-добре как влакната от пациенти с миопатия се сравняват със здрави влакна, използвахме подробна информация, получена от протеомен анализ на 1000 влакна от здрави възрастни участници. Проектирахме влакна от набора от данни за миопатия (пациенти с ACTA1 и TNNT1 немалинова миопатия и контроли) върху PCA графиката, получена от протеомния анализ с 1000 влакна (Фигура 6D). Разпределението на типовете влакна MYH по протежение на PC2 в контролните влакна е подобно на разпределението на влакната, получено от протеомния анализ с 1000 влакна. Въпреки това, повечето влакна при пациенти с немалинова миопатия се изместиха надолу по PC2, припокривайки се със здрави бързосъкращаващи се влакна, независимо от техния естествен тип MYH влакна. По този начин, въпреки че пациентите с ACTA1 немалинова миопатия показаха изместване към влакна тип 1, когато бяха количествено определени с помощта на MYH-базирани методи, както ACTA1 немалинова миопатия, така и TNNT1 немалинова миопатия изместиха протеома на скелетните мускулни влакна към бързосъкращаващи се влакна.
След това директно сравнихме всяка група пациенти със здрави контроли и идентифицирахме съответно 256 и 552 диференциално експресирани протеина при ACTA1 и TNNT1 немалинови миопатии (Фигура 6E–G и Допълнителна фигура 11C, Допълнителен набор от данни 21). Анализът на генното обогатяване разкри координирано намаляване на митохондриалните протеини (Фигура 6H–I, Допълнителен набор от данни 22). Изненадващо, въпреки диференциалното преобладаване на типовете влакна при ACTA1 и TNNT1 немалинови миопатии, това намаление беше напълно независимо от типа влакна, базиран на MYH (Фигура 6H и Допълнителни фигури 11D–I, Допълнителен набор от данни 23). Три микробни протеина също бяха регулирани при ACTA1 или TNNT1 немалинови миопатии. Два от тези микропротеини, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (известен също като LINC00598 или Lnc-FOXO1) и ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), показват различно изобилие само в миофибри тип 1. По-рано е съобщено, че ENSG00000215483_TR14_ORF67 играе роля в регулацията на клетъчния цикъл.56 От друга страна, ENSG00000232046_TR1_ORF437 (съответстващ на LINC01798) е повишен както в миофибри тип 1, така и в тип 2A при ACTA1-немалин миопатия в сравнение със здрави контроли (Допълнителна фигура 12A, Допълнителен набор от данни 24). За разлика от това, рибозомните протеини не са били до голяма степен засегнати от немалиновата миопатия, въпреки че RPS17 е бил понижен при ACTA1 немалиновата миопатия (фиг. 6E).
Анализът на обогатяването също така разкри повишена регулация на процесите на имунната система при ACTA1 и TNNT1 немалинови миопатии, докато клетъчната адхезия също беше повишена при TNNT1 немалинова миопатия (Фигура 6H). Обогатяването на тези извънклетъчни фактори се отразява от изместването на PCA в PC1 и PC2 от страна на извънклетъчните матриксни протеини в отрицателна посока (т.е. към най-засегнатите влакна) (Фигура 6J). И двете групи пациенти показват повишена експресия на извънклетъчни протеини, участващи в имунните отговори и механизмите за възстановяване на сарколемата, като анексини (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 и техния взаимодействащ протеин S100A1159 (Допълнителни фигури 12B–C). По-рано е съобщено, че този процес се засилва при мускулни дистрофии60, но доколкото ни е известно, не е бил свързван преди това с немалинови миопатии. Нормалната функция на този молекулярен механизъм е необходима за възстановяването на сарколемата след нараняване и за сливането на новообразувани миоцити с миофибри58,61. Следователно, повишената активност на този процес и в двете групи пациенти предполага репаративен отговор на увреждане, причинено от нестабилност на миофибрите.
Ефектите от всяка немалинова миопатия бяха добре корелирани (r = 0,736) и показаха разумно припокриване (допълнителни фигури 11A–B), което показва, че ACTA1 и TNNT1 немалиновата миопатия имат сходни ефекти върху протеома. Някои протеини обаче бяха регулирани само при ACTA1 или TNNT1 немалиновата миопатия (допълнителни фигури 11A и C). Профибротичният протеин MFAP4 беше един от най-повишено регулираните протеини при TNNT1 немалиновата миопатия, но остана непроменен при ACTA1 немалиновата миопатия. SKIC8, компонент на PAF1C комплекса, отговорен за регулирането на транскрипцията на HOX гена, беше понижено регулиран при TNNT1 немалиновата миопатия, но не беше засегнат при ACTA1 немалиновата миопатия (допълнителна фигура 11A). Директното сравнение на ACTA1 и TNNT1 немалиновата миопатия разкрива по-голямо намаляване на митохондриалните протеини и увеличаване на протеините на имунната система при TNNT1 немалиновата миопатия (Фигура 6G–H и Допълнителни фигури 11C и 11H–I). Тези данни са в съответствие с по-голямата атрофия/дистрофия, наблюдавана при TNNT1 немалиновата миопатия в сравнение с TNNT1 немалиновата миопатия (Фигура 6A), което предполага, че TNNT1 немалиновата миопатия представлява по-тежка форма на заболяването.
За да оценим дали наблюдаваните ефекти на немалиновата миопатия персистират на ниво цяло мускулно тяло, извършихме обемен протеомен анализ на мускулни биопсии от същата кохорта пациенти с TNNT1 немалинова миопатия и ги сравнихме с контролите (n=3 на група) (Допълнителна фигура 13A, Допълнителен набор от данни 25). Както се очакваше, контролите бяха тясно свързани в анализа на главните компоненти, докато пациентите с TNNT1 немалинова миопатия показаха по-висока междупробна вариабилност, подобна на наблюдаваната при анализа на единични влакна (Допълнителна фигура 13B). Обемният анализ възпроизведе диференциално експресираните протеини (Допълнителна фигура 13C, Допълнителен набор от данни 26) и биологичните процеси (Допълнителна фигура 13D, Допълнителен набор от данни 27), подчертани чрез сравняване на отделни влакна, но загуби способността да прави разлика между различните типове влакна и не успя да отчете хетерогенните ефекти на заболяването в различните влакна.
Взети заедно, тези данни показват, че протеомиката на единични миофибри може да изясни клиничните биологични характеристики, които не могат да бъдат открити чрез целенасочени методи като имуноблотинг. Освен това, тези данни подчертават ограниченията при използването само на типизиране на актинови влакна (MYH) за описание на фенотипната адаптация. Всъщност, въпреки че превключването на типа влакна се различава между актиновите и тропониновите немалинови миопатии, и двете немалинови миопатии разделят MYH типизирането на влакна от метаболизма на скелетните мускулни влакна към по-бърз и по-малко оксидативен мускулен протеом.
Клетъчната хетерогенност е от решаващо значение за тъканите, за да отговорят на разнообразните си нужди. В скелетните мускули това често се описва като типове влакна, характеризиращи се с различна степен на производство на сила и умора. Ясно е обаче, че това обяснява само малка част от вариабилността на влакната на скелетните мускули, която е много по-променлива, сложна и многостранна, отколкото се смяташе преди. Технологичният напредък вече хвърля светлина върху факторите, регулиращи влакната на скелетните мускули. Всъщност, нашите данни показват, че влакната тип 2X може да не са отделен подтип влакна на скелетните мускули. Освен това, ние идентифицирахме метаболитни протеини, рибозомни протеини и клетъчно-асоциирани протеини като основни детерминанти на хетерогенността на влакната на скелетните мускули. Чрез прилагане на нашия протеомен работен процес към проби от пациенти с нематодна миопатия, ние допълнително демонстрирахме, че типизирането на влакната, базирано на MYH, не отразява напълно хетерогенността на скелетните мускули, особено когато системата е нарушена. Всъщност, независимо от типа влакна, базирано на MYH, нематодната миопатия води до изместване към по-бързи и по-малко окислителни влакна.
Скелетните мускулни влакна са класифицирани от 19-ти век. Последните омик анализи ни позволиха да започнем да разбираме профилите на експресия на различни типове MYH влакна и техните реакции към различни стимули. Както е описано тук, омик подходите имат и предимството на по-голяма чувствителност за количествено определяне на маркери за тип влакна в сравнение с традиционните методи, базирани на антитела, без да се разчита на количествено определяне на един (или няколко) маркера, за да се дефинира тип скелетно мускулно влакно. Използвахме допълнителни транскриптомни и протеомни работни потоци и интегрирахме резултатите, за да изследваме транскрипционната и посттранскрипционната регулация на хетерогенността на влакната в човешките скелетни мускулни влакна. Този работен процес доведе до невъзможност за идентифициране на чисти 2X-тип влакна на протеиново ниво в vastus lateralis на нашата кохорта от здрави млади мъже. Това е в съответствие с предишни проучвания на единични влакна, които откриха <1% чисти 2X влакна в здрав vastus lateralis, въпреки че това трябва да бъде потвърдено и в други мускули в бъдеще. Несъответствието между откриването на почти чисти 2X влакна на ниво mRNA и само смесени 2A/2X влакна на протеиново ниво е озадачаващо. Експресията на мРНК на MYH изоформата не е циркадна,67 което предполага, че е малко вероятно да сме „пропуснали“ началния сигнал на MYH2 в привидно чисти 2X влакна на ниво РНК. Едно възможно обяснение, макар и чисто хипотетично, може да бъде разликата в стабилността на протеините и/или мРНК между MYH изоформите. Всъщност, никое бързо влакно не е 100% чисто за която и да е MYH изоформа и не е ясно дали нивата на експресия на MYH1 мРНК в диапазона 70–90% биха довели до еднакво изобилие на MYH1 и MYH2 на ниво протеин. Въпреки това, когато се разглежда целият транскриптом или протеом, клъстерният анализ може уверено да идентифицира само два отделни клъстера, представляващи бавни и бързи скелетни мускулни влакна, независимо от точния им MYH състав. Това е в съответствие с анализите, използващи едноядрени транскриптомни подходи, които обикновено идентифицират само два отделни мионуклеарни клъстера. 68, 69, 70 Освен това, въпреки че предишни протеомни изследвания са идентифицирали влакна тип 2X, тези влакна не се групират отделно от останалите бързи влакна и показват само малък брой различно изобилни протеини в сравнение с други типове влакна, базирани на MYH. 14 Тези резултати предполагат, че трябва да се върнем към възгледа за класификацията на мускулните влакна от началото на 20-ти век, който разделя човешките скелетни мускулни влакна не на три отделни класа, базирани на MYH, а на два клъстера, базирани на техните метаболитни и контрактилни свойства. 63
По-важното е, че хетерогенността на миофибрите трябва да се разглежда в множество измерения. Предишни „омик“ изследвания сочат в тази посока, предполагайки, че скелетните мускулни влакна не образуват отделни клъстери, а са разположени по континуум. 11, 13, 14, 64, 71 Тук показваме, че освен разликите в контрактилните и метаболитни свойства на скелетните мускули, миофибрите могат да бъдат диференцирани по характеристики, свързани с клетъчно-клетъчните взаимодействия и механизмите на транслация. Наистина, открихме хетерогенност на рибозомите в скелетните мускулни влакна, която допринася за хетерогенност, независимо от бавните и бързите типове влакна. Основната причина за тази значителна хетерогенност на миофибрите, независимо от типа бавни и бързи влакна, остава неясна, но може да сочи към специализирана пространствена организация в мускулните снопчета, които оптимално реагират на специфични сили и натоварвания,72 специализирана клетъчна или органо-специфична комуникация с други типове клетки в мускулната микросреда73,74,75 или разлики в рибозомната активност в отделните миофибри. Всъщност, рибозомната хетероплазмия, или чрез паралогично заместване на RPL3 и RPL3L, или на ниво 2'O-метилиране на рРНК, е доказано свързана с хипертрофия на скелетните мускули76,77. Мулти-омичните и пространствени приложения, комбинирани с функционална характеристика на отделните миофибри, ще доразвият нашето разбиране за мускулната биология на мулти-омично ниво78.
Чрез анализ на протеомите на единични миофибри от пациенти с немалинови миопатии, ние също така демонстрирахме полезността, ефективността и приложимостта на протеомиката на единични миофибри за изясняване на клиничната патофизиология на скелетните мускули. Освен това, чрез сравняване на нашия работен процес с глобалния протеомен анализ, успяхме да демонстрираме, че протеомиката на единични миофибри дава същата дълбочина на информация като глобалната тъканна протеомика и разширява тази дълбочина, като отчита междуфибърната хетерогенност и типа миофибри. В допълнение към очакваните (макар и променливи) разлики в съотношението на типовете влакна, наблюдавани при ACTA1 и TNNT1 немалинови миопатии в сравнение със здрави контроли,19 наблюдавахме също оксидативно и извънклетъчно ремоделиране, независимо от MYH-медиираното превключване на типовете влакна. Фиброза е била съобщавана и преди при TNNT1 немалинови миопатии.19 Нашият анализ обаче се основава на това откритие, като разкрива и повишени нива на извънклетъчни секретирани протеини, свързани със стреса, като анексини, участващи в механизмите за възстановяване на сарколемата, в миофибри от пациенти с ACTA1 и TNNT1 немалинови миопатии.57,58,59 В заключение, повишените нива на анексин в миофибрите от пациенти с немалинова миопатия могат да представляват клетъчен отговор за възстановяване на силно атрофични миофибри.
Въпреки че това проучване представлява най-големият анализ на цялостна мускулна омика на единични влакна при хора до момента, той не е без ограничения. Изолирахме скелетните мускулни влакна от относително малка и хомогенна извадка от участници и един единствен мускул (vastus lateralis). Следователно е невъзможно да се изключи съществуването на специфични популации от влакна в различните мускулни типове и в крайности на мускулната физиология. Например, не можем да изключим възможността за поява на подмножество от ултрабързи влакна (напр. чисти 2X влакна) при високо тренирани спринтьори и/или силови спортисти79 или по време на периоди на мускулна неактивност66,80. Освен това, ограниченият размер на извадката от участниците ни попречи да изследваме половите разлики в хетерогенността на влакната, тъй като е известно, че съотношенията на типовете влакна се различават между мъжете и жените. Освен това, не успяхме да проведем транскриптомни и протеомни анализи на едни и същи мускулни влакна или проби от едни и същи участници. Тъй като ние и други продължаваме да оптимизираме анализите на единични клетки и единични миофибри, използвайки омик анализ, за ​​да постигнем ултра-нисък вход на пробата (както е показано тук при анализа на влакна от пациенти с митохондриална миопатия), възможността за комбиниране на мулти-омик (и функционални) подходи в рамките на единични мускулни влакна става очевидна.
Като цяло, нашите данни идентифицират и обясняват транскрипционните и посттранскрипционните фактори, водещи до хетерогенност на скелетните мускули. По-конкретно, представяме данни, които оспорват дългогодишна догма във физиологията на скелетните мускули, свързана с класическата дефиниция за типовете влакна, базирана на MYH. Надяваме се да подновим дебата и в крайна сметка да преосмислим разбирането си за класификацията и хетерогенността на скелетните мускулни влакна.
Четиринадесет участници от бялата раса (12 мъже и 2 жени) доброволно се съгласиха да участват в това проучване. Проучването беше одобрено от Етичната комисия на Университетската болница в Гент (BC-10237), отговаряше на Декларацията от Хелзинки от 2013 г. и беше регистрирано в ClinicalTrials.gov (NCT05131555). Общите характеристики на участниците са представени в Допълнителна таблица 1. След получаване на устно и писмено информирано съгласие, участниците преминаха медицински преглед преди окончателното включване в проучването. Участниците бяха млади (22–42 години), здрави (без медицински състояния, без история на тютюнопушене) и умерено физически активни. Максималното усвояване на кислород беше определено с помощта на степ ергометър за оценка на физическата годност, както е описано по-рано. 81
Проби от мускулна биопсия бяха събрани в покой и на гладно три пъти, през 14 дни. Тъй като тези проби бяха събрани като част от по-голямо проучване, участниците консумираха плацебо (лактоза), H1-рецепторен антагонист (540 mg фексофенадин) или H2-рецепторен антагонист (40 mg фамотидин) 40 минути преди биопсията. По-рано демонстрирахме, че тези антагонисти на хистаминовите рецептори не влияят на физическата форма на скелетните мускули в покой81 и не е наблюдавано групиране, свързано със състоянието, в нашите графики за контрол на качеството (Допълнителни фигури 3 и 6). Стандартизирана диета (41,4 kcal/kg телесно тегло, 5,1 g/kg телесно тегло въглехидрати, 1,4 g/kg телесно тегло протеини и 1,6 g/kg телесно тегло мазнини) беше поддържана в продължение на 48 часа преди всеки експериментален ден, а стандартизирана закуска (1,5 g/kg телесно тегло въглехидрати) беше консумирана сутринта на експерименталния ден. Под локална анестезия (0,5 ml 1% лидокаин без епинефрин) бяха получени мускулни биопсии от мускула vastus lateralis чрез перкутанна аспирация на Бергстрьом.82 Мускулни проби бяха незабавно вградени в RNAlater и съхранявани при 4°C до ръчна дисекция на влакната (до 3 дни).
Прясно изолирани снопчета миофибри бяха прехвърлени в прясна RNAlater среда в културална плака. След това отделните миофибри бяха ръчно дисектирани с помощта на стереомикроскоп и фини пинсети. Двадесет и пет влакна бяха дисектирани от всяка биопсия, като се обърна специално внимание на селекцията на влакна от различни области на биопсията. След дисекцията всяко влакно беше внимателно потопено в 3 μl лизисен буфер (SingleShot Cell Lysis Kit, Bio-Rad), съдържащ протеиназа К и ДНКаза ензими, за да се отстранят нежеланите протеини и ДНК. Клетъчният лизис и отстраняването на протеини/ДНК бяха инициирани чрез кратко вортексиране, центрофугиране на течността в микроцентрофуга и инкубация при стайна температура (10 минути). След това лизатът беше инкубиран в термоциклер (T100, Bio-Rad) при 37°C за 5 минути, 75°C за 5 минути и след това незабавно съхраняван при -80°C до по-нататъшна обработка.
Illumina-съвместими полиаденилирани РНК библиотеки бяха приготвени от 2 µl миофибърен лизат, използвайки QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq Library Prep Kit (Lexogen). Подробни методи могат да бъдат намерени в ръководството на производителя. Процесът започва със синтез на кДНК от първата верига чрез обратна транскрипция, по време на който се въвеждат уникални молекулярни идентификатори (UMI) и специфични за пробата i1 баркодове, за да се осигури обединяване на пробите и да се намали техническата вариабилност по време на последващата обработка. кДНК от 96 миофибрили след това се обединява и пречиства с магнитни перли, след което РНК се отстранява и се извършва синтез на втората верига с помощта на произволни праймери. Библиотеката се пречиства с магнитни перли, добавят се специфични за пула i5/i7 тагове и се амплифицира чрез PCR. Последната стъпка на пречистване произвежда Illumina-съвместими библиотеки. Качеството на всеки библиотечен пул беше оценено с помощта на High Sensitivity Small Fragment DNA Analysis Kit (Agilent Technologies, DNF-477-0500).
Въз основа на количественото определяне на Qubit, пуловете бяха допълнително обединени при еквимоларни концентрации (2 nM). Полученият пул беше секвениран на NovaSeq 6000 инструмент в стандартен режим, използвайки NovaSeq S2 Reagent Kit (1 × 100 нуклеотида) с 2 nM зареждане (4% PhiX).
Нашият конвейер е базиран на конвейера за анализ на данни QuantSeq Pool на Lexogen (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis). Данните първо бяха демултиплексирани с bcl2fastq2 (v2.20.0) въз основа на индекса i7/i5. След това Четене 2 беше демултиплексирано с idemux (v0.1.6) въз основа на баркода на пробата i1, а UMI последователностите бяха извлечени с umi_tools (v1.0.1). След това четенията бяха подрязани с cutadapt (v3.4) в няколко кръга, за да се премахнат къси четения (<20 с дължина) или четения, състоящи се единствено от адапторни последователности. След това четенията бяха подравнени с човешкия геном, използвайки STAR (v2.6.0c), а BAM файловете бяха индексирани със SAMtools (v1.11). Дублираните четения бяха премахнати, използвайки umi_tools (v1.0.1). Накрая, преброяването на подравняванията беше извършено с помощта на featureCounts в Subread (v2.0.3). Контролът на качеството беше извършен с помощта на FastQC (v0.11.9) на няколко междинни етапа от тръбопровода.
Цялата по-нататъшна биоинформатична обработка и визуализация бяха извършени в R (v4.2.3), предимно с помощта на работния процес Seurat (v4.4.0).83 Следователно, отделните UMI стойности и матрици на метаданни бяха трансформирани в Seurat обекти. Гените, експресирани в по-малко от 30% от всички влакна, бяха премахнати. Пробите с ниско качество бяха премахнати въз основа на минимален праг от 1000 UMI стойности и 1000 открити гена. В крайна сметка 925 влакна преминаха всички стъпки на филтриране за контрол на качеството. UMI стойностите бяха нормализирани с помощта на метода Seurat SCTransform v2,84 включително всички 7418 открити характеристики, а разликите между участниците бяха регресирани. Всички съответни метаданни могат да бъдат намерени в Допълнителен набор от данни 28.